[发明专利]一种长效稳定表达的杆状病毒载体及其构建方法

说明书

本发明涉及一种重组杆状病毒载体及其构建方法，所述重组杆状病毒载体包含SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因，所述构建方法包含将SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因克隆至杆状病毒载体的步骤。本发明构建的重组杆状病毒表达系统，能够实现外源蛋白的长效、稳定表达。利用本发明构建的重组杆状病毒表达系统在小鼠体内表达hEA(内皮抑素和血管抑素的融合蛋白)，显著提高了荷瘤小鼠的寿命和存活率。本发明的重组杆状病毒表达系统还能有效抵抗血清补体系统的攻击，还能同时借助SB转座系统表达EGFP等荧光蛋白，便于在哺乳动物细胞中持续观察荧光的表现。

技术领域

本发明涉及基因工程学技术领域，尤其涉及一种能够长效、稳定表达外源基因的杆状病毒载体的构建方法。

背景技术

近年来，杆状病毒作为基因传递载体用于基因治疗成为了研究的热点。杆状病毒较其他病毒如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等具有独特的优点，如对人类和哺乳动物不引起致病，能在I级生物安全实验室进行操作；在哺乳动物细胞中复制缺陷，没有预先存在的抗体；低的细胞毒性；能容纳大片段外源基因插入；重组病毒的构建及纯化操作简单。此外，杆状病毒除了能实现有效的基因传递，还被证明可以刺激哺乳动物细胞产生抗病毒免疫反应，抵抗病毒的攻击以及抵抗肿瘤的生长转移。然而杆状病毒一些固有的缺陷限制了其进一步的应用。例如，杆状病毒表达外源基因水平低，导致重组蛋白的生产成本高，限制了其市场化应用；杆状病毒不能在哺乳动物细胞中复制，随着时间的增加，基因组逐渐降解，导致无法长期有效的表达目的基因，限制了其作为基因治疗载体的进一步应用；哺乳动物体内存在补体，补体是先天免疫反应的组成部分，可导致杆状病毒被清除，转导效率急剧下降；杆状病毒表达蛋白具有特异性，不同类型蛋白的表达水平差异很大，尤其是跨膜蛋白和糖蛋白的稳定高水平表达更是困难。上述缺陷导致杆状病毒在实际应用中难以长效、稳定的表达外源蛋白，限制了杆状病毒系统的实际应用。

为了提高杆状病毒的表达时间或表达稳定性，研究人员已经在多个方向做出尝试。例如，选择脑、眼睛和睾丸等不能产生天然免疫反应的免疫赦免位点作为基因运输的转导位点；体外转导避免杆状病毒与血清补体的接触；使用补体的药理抑制剂灭活补体；转入衰减加速因子(DAF)、膜辅助因子蛋白(MCP)、CD59等补体调节蛋白基因以抑制补体；利用化学方式对杆状病毒进行表面加工；引入长效表达转座子；选择低感染复数(MOI)的杆状病毒进行感染以减少缺损干扰(DI)的产生；删除p94基因中的non-hr DNA复制原点以提高基因组稳定性；删除不需要的病毒基因以容纳更多外源基因并增加其产量。然而，在上述策略中，免疫赦免位点转导和体外转导的方法限制了其临床应用的范围，药理抑制剂的潜在副作用仍然有待于进一步的评估，DAF等补体调节蛋白作为跨膜蛋白在杆状病毒中的表达水平和表达时间都十分有限，化学修饰加工需要在批次稳定性和病毒感染力方面做许多优化工作。因此，仍然存在开发新的能够实现外源蛋白长效、稳定表达的杆状病毒载体系统的需求。

发明内容

针对现有杆状病毒载体的缺陷，本发明提供一种能够长效、稳定表达外源蛋白的新的杆状病毒载体，本发明基于发明人意想不到的发现，即在尝试了各种提高杆状病毒载体表达时间和表达稳定性的手段后，发现在将SB转座子(“睡美人”转座系统)转入杆状病毒载体，并使所述病毒能够表达DAF蛋白后，其对外源蛋白的表达时间和稳定性都有显著提高。

为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面提供一种重组杆状病毒载体，所述重组杆状病毒载体包含SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因。

本发明另一方面提供重组杆状病毒载体的构建方法，所述方法包含将SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因克隆至杆状病毒载体的步骤。