[发明专利]一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA及构建的表达载体和应用

说明书

本发明属生物医药以及分子生物学技术领域，涉及一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA，靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体。构建的RNA干扰重组慢病毒载体用于抑制食管癌细胞EGFL6基因表达，以有效抑制食管癌细胞EGFL6基因表达。所述siRNA为双链，标记为si EGFL6，利用失活慢病毒载体携带UCP2 RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成shRNA,完美的解决了RNA干扰的靶向性、安全性以及表达持续性的问题。将目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小，是一种比较理想的用于导入肿瘤细胞，用于EGFL6基因在肿瘤细胞中沉默的干扰载体。

技术领域

本发明属于生物医药以及分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA及构建的表达载体和应用。

背景技术

当今社会肿瘤的发病率和死亡率越来越高，由于肿瘤的侵袭性强且易转移，患者就诊时大多数都已处于中晚期，手术及放化疗疗效均有限。肿瘤的生长，发展和转移依赖新血管的生成，目前研究最为明确血管生成因子为内皮细胞生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF），并针对VEGF开发了多种抗血管生成药物，其中使用最为广泛的抗血管生成药物是贝伐单抗（bevacizumab），是一种阻断VEGF-A活性的单克隆抗体，已应用到多种肿瘤的治疗中，并取得了一定的疗效。但随着这种药物的使用，高血压、出血性休克、创伤愈合受损等特殊的不良反应也随着成为一个重要的问题，而且鉴于抗VEGF药物对伤口愈合的影响，这类药物也不适合在围手术期使用。因此，寻找抗肿瘤血管生成的独特靶点已成为当前肿瘤治疗领域亟待解决的关键性问题。

EGFL6是EGF超家族的成员，近年来众多学者的研究表明EGFL6在肿瘤相关内皮细胞中高度表达，而正常组织和伤口相关的内皮细胞表达较低，成为肿瘤血管中具有独特作用的重要靶点，且参与多种肿瘤的发生、发展过程成为目前肿瘤治疗研究的一大热点。

前期的研究表明EGFL6在卵巢肿瘤相关内皮细胞中高度表达，而正常卵巢和伤口相关的内皮细胞表达较低，成为肿瘤血管中具有独特作用的重要靶点。食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位于全部恶性肿瘤的第八位和第六位。我国食管癌呈高发状态，山西、河南以及河北更是“食管癌高发带”。我们前期通过免疫组化证实与正常食管组织相比，食管癌组织中EGFL6表达较高，因此推测EGFL6通过调控食管肿瘤组织的血管生成而参与肿瘤的发生发展，针对EGFL6的靶向治疗可能成为食管肿瘤抗血管生成治疗的新靶点。基于上述结论，欲利用食管癌细胞证明 EGFL6基因与肿瘤发生发展之间的联系，及探索其引起肿瘤发生发展的机制。因此，需要构建一个EGFL6基因功能研究模型，并在后续机制研究中发挥重要作用。目前，关于食管癌中EGFL6基因相关的siRNA及表达载体还未见研究报道。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。