[发明专利]一种非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法

说明书

本发明公开了一种非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法，包括以下步骤：(1)血清C反应蛋白(CRP)的纯化富集；(2)C反应蛋白纯度检测；(3)酶切；(4)C反应蛋白定量分析。该方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素，整个实验只需要考虑纯品CRP浓度的准确性，而本发明使用的纯品CRP溶液是国家一级标准物质(由中国计量院研制)，数值可靠、可溯源至SI单位，并且原料是天然CRP，也无需考虑结构的差异，而这也是相较于同位素标记的全蛋白优异的地方。

技术领域

本发明涉及蛋白含量测定技术领域，特别是涉及一种血清中C反应蛋白的定值方法。

背景技术

C反应蛋白是由肝脏释放的五聚体结构的血清蛋白，可用于监测心血管疾病和全身炎症状况，是重要的临床标志物之一。由于其稳定性好，单克隆抗体商品化，因而具有临床应用价值，常用的检测方法有酶联免疫吸附法、免疫投射比浊法和免疫发光法等。但是由于各厂家针对不同的目标物开发方法和试剂，造成测量的偏差很大。因此，亟需研制出CRP的参考测量方法。

同位素稀释质谱法具有灵敏度高、定量测量准确性高、重复性好的特点，是一种权威的定量方法，被广泛应用于蛋白和肽段的含量测定。多年来，许多科学家致力于CRP方法学的研究中。宋德伟等人建立的CRP的IDMS-LC/MS检测方法，是对CRP蛋白进行水解，通过对氨基酸的定量分析，准确测定CRP浓度，使定量结果可溯源至SI单位。同样，日本计量院(NMIJ)开发了一种可溶性重组人CRP有证参考材料CRM 6201-b，其纯度和均匀性均高于人血清纯化物。这两篇文献采用的氨基酸水解法相对比较成熟，其分析测定的干扰较小，但是对样品的纯度要求较高，杂质亦或是样品降解都会对其产生很大的影响，不适用于血清样品。

美国计量院(NIST)Eric L等人通过标准添加法对CRP进行定量，消除了潜在的酶解偏差，并且通过外部校准曲线验证其准确性，但只选择了两条肽段进行定量分析。不同于上述文献采用磁珠富集的方法将CRP从血清样品中提取出来，Caroline Pritchard等人采用高、低pH两步固相萃取(SPE)工艺，将血清样品中的CRP纯化，而后进行酶解和LC-MS/MS，此方法步骤繁琐，并且回收率低。此外，还有不经过纯化直接酶切进质谱的方法，这一方法很容易产生杂质肽段，不适用于大部分蛋白。这些文献采用的方法都是基于蛋白质被胰蛋白酶酶解成特征肽段。需要肽段在整个消化过程中保持稳定，不发生修饰或降解，并且能够进行质谱分析。但由于酶解效率不同会导致较大的偏差，而且选择多肽段定值可能会导致肽段分不开，而重新选择肽段则需要更大的人力物力。

无论是水解为氨基酸还是酶解为肽段，都没有蛋白的完整结构，而同位素标记的完整蛋白由于结构的相似性，实验过程中产生的偏差会无差别的应用于两种蛋白，无需考虑蛋白纯化、酶切效率以及基质效应。后来，Eric L致力于同位素标记的完整CRP研究中，通过酵母表达系统产生15N标记的rCRP(15N-rCRP)，作为ID-MS的内标，可真实的反应样品的浓度。但是同位素标记的全蛋白产量低，耗时耗力，价格及其昂贵，并且天然蛋白质和其同位素标记的类似物在三级结构上有微小的差异。结构性差异可能导致基质中非特异性结合的相互作用，蛋白质水平的不同导致纯化阶段回收率的不同，此外还涉及结构识别如免疫亲和纯化，或由于基质中自然和标记蛋白质结构的不同，导致降解程度的不同。

发明内容

本发明的目的是提供一种非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法。该方法是一种高效、简便、可靠的检测方法，为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法，包括以下步骤：

(1)血清C反应蛋白(CRP)的纯化富集：将磁珠活化，按比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物。在血清样品中加入一定量的磁珠抗体复合物，孵育洗涤；用三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的CRP洗脱下来，-20℃保存使用。