[发明专利]一种非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)血清C反应蛋白的纯化富集：将磁珠活化，按比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物；在血清样品中加入一定量的磁珠抗体复合物，孵育洗涤；用三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的CRP洗脱下来，-20℃保存使用；

(2)C反应蛋白纯度检测；

(3)酶切肽段EK、GK、RK：对血清样品进行亲和纯化；磁珠提取后离心浓缩；加入少量的去离子水复溶；加入尿素、DTT，于37℃变性；加入IAM，避光反应；加入碳酸氢铵溶液稀释，使尿素浓度降至1mol/L以下；按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应；

(4)C反应蛋白定量分析：将酶切好的样品进质谱，通过肽段的浓度推算出C反应蛋白的浓度，而肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算C反应蛋白浓度，以3者平均值定值；

根据肽段EK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-EK＝A_{纯品CRP-L-EK}

根据肽段GK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-GK＝A_{纯品CRP-L-GK}

根据肽段RK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-RK＝A_{纯品CRP-L-RK}

式中:c_CRP为血清样品的浓度；c_CRP-EK、c_CRP-GK、c_CRP-RK为血清CRP酶切肽段EK、GK、RK的浓度；A_CRP-EK、A_CRP-GK、A_CRP-RK为血清CRP酶切肽段EK、GK、RK的峰面积；A_CRP-L-EK、A_CRP-L-GK、A_CRP-L-RK为添加到血清样品中的标记肽段L-EK、L-GK、L-RK的峰面积；c_纯品CRP-EK、c_纯品CRP-GK、c_纯品CRP-RK为空白血清添加已知浓度的纯品CRP酶切肽段EK、GK、RK的浓度；A_纯品CRP-EK、A_纯品CRP-GK、A_纯品CRP-RK为纯品CRP酶切肽段EK、GK、RK的峰面积；A_{纯品CRP-L-EK}、A_{纯品CRP-L-GK}、A_{纯品CRP-L-RK}为同时添加到纯品CRP中的标记肽段L-EK、L-GK、L-RK的峰面积；c_纯品CRP为纯品CRP的浓度。

2.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，将磁珠活化，按照抗体：磁珠＝40μg：1mg的比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物，浓度在1～10mg/mL；所述磁珠为含有磺酸酯键的聚苯乙烯珠子

取血清样品于1.5mL的离心管中；加入一定量的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的C反应蛋白结合到磁珠抗体上，去上清；用1mL的TBST洗涤磁珠3次；再用1mL的TBS洗涤1次；加入终浓度为0.1％三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的C反应蛋白洗脱下来，室温旋转孵育1h；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。

3.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)中，用SDS-Page电泳法和液相色谱法检测纯度。

4.根据权利要求3所述的非疾病诊断目的的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)SDS-Page电泳法具体为，在CRP溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。