[发明专利]一种表达E2-crimson的重组伪狂犬病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种表达E2‑crimson的重组伪狂犬病毒及其制备方法和应用，所述表达E2‑crimson的重组伪狂犬病毒的重组载体为包括E2‑crimson基因的pBB5‑E2‑crimson载体。本发明的重组伪狂犬病毒中采用的红色荧光蛋白E2‑crimson荧光强度高、成熟时间快、透射能力强，对细菌和哺乳动物细胞无细胞毒性，制备的重组伪狂犬病毒在小鼠纹状体中可以高效地逆向标记神经环路，表达效率高，侵染能力强，在神经环路示踪领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于神经工程技术领域，涉及一种表达E2-crimson的重组伪狂犬病毒及其制备方法和应用。

背景技术

神经系统是由数目众多的神经元相互连接而构成的复杂神经网络。揭示各个功能神经元之间的连接方式是神经科学研究领域的基本问题，对于理解大脑正常功能和神经系统疾病的病理机制具有十分重要的意义。以描绘神经元连接方式为目的的神经环路示踪技术是目前脑科学研究的关键，位列美国脑计划九个优先资助项目的第二名，也是欧洲脑计划实施的基础和韩国脑计划的核心。

现有的神经环路示踪剂包括荧光染料、生物素和嗜神经病毒等。其中，以荧光染料和生物素为代表的传统示踪剂在神经组织中的扩散没有严格的突触特异性，应用于示踪神经突触连接具有很大的局限性。

嗜神经病毒由于其能够感染神经元并沿神经突触传递，在神经环路示踪中得到了广泛的应用。与传统的示踪剂相比，嗜神经病毒具有可携带外源基因、能够自我复制进行信号扩大、跨突触传播等特性，是目前最常用的神经环路示踪剂。现常用的神经网络示踪病毒包括单纯疱疹病毒、狂犬病毒和水泡口炎病毒等。其中，隶属于单纯疱疹病毒家族的伪狂犬病毒PRV由于其逆向跨突触传播、可携载大片段外源基因和生物安全性高等特点，是当前最具开发潜力的神经示踪工具病毒之一。野生型PRV-Becker株可以沿突触双向示踪，改造后的减毒株PRV-Bartha只能逆向跨突触传递，应用于神经环路示踪中的大多数病毒是在减毒株PRV-Bartha基础上改造的重组PRV，因此只能进行逆向传递标记。

目前，已有多种表达绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的重组PRV病毒，例如表达绿色荧光蛋白EGFP的PRV152，表达红色荧光蛋白DsRed的PRV600和PRV613、以及表达红色荧光蛋白mRFP的PRV614。DsRed是第一个被发现的红色荧光蛋白，克隆自Discosoma珊瑚，后续发展了一系列单体红色荧光蛋白mRFP。目前常用的携带红色荧光蛋白基因的PRV为PRV614，通常将其单独或者与其他颜色PRV共同注射到小鼠的特定脑区，研究相关的神经环路。

在神经环路示踪研究中，通常需要同时使用2-3种不同荧光蛋白；在不同的脑区分别注射带有不同颜色荧光蛋白的PRV，经过一段时间后观察荧光蛋白的表达分布情况，被两种荧光同时标记到的神经元，说明同时与两个脑区有联系。例如，徐富强教授实验室曾向C57/BL小鼠两侧嗅球分别注射PRV152(GFP)和PRV614(RFP)，经过一段时间逆行，在嗅觉相关脑区观察到红色和绿色共同标记的神经元，说明这些神经元调控了双侧嗅球。

然而，目前已有的表达红色荧光蛋白的重组PRV病毒普遍存在荧光强度弱、成熟时间长、透射能力差等问题，不利于神经网络示踪研究。因此，有必要开发一种新的携带红色荧光蛋白的重组PRV，使其表达的红色荧光蛋白亮度更强、成熟速度更快，更好地应用于神经环路示踪。

发明内容

针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种表达E2-crimson的重组伪狂犬病毒及其制备方法和应用，所述重组伪狂犬病毒中采用的红色荧光蛋白E2-crimson荧光强度高、成熟时间快、透射能力强，在神经环路示踪领域具有广泛的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种重组伪狂犬病毒载体，所述重组伪狂犬病毒载体包括E2-crimson基因；

所述E2-crimson基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；