[发明专利]一种重组人源I型胶原蛋白、编码基因、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种重组人源I型胶原蛋白、编码基因、工程菌及其在制备胶原制剂中的应用，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明重组人源I型胶原蛋白采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，18小时即可完成一轮发酵，生产成本非常低，周期短，提高了目的蛋白的产量。

(一)技术领域

本发明涉及一种重组人源I型胶原蛋白及其应用。

(二)背景技术

胶原蛋白为生物体提供了一种机械支撑作用，维护器官与组织的完整性，保障其正常功能的行使，这对于实质性器官而言非常重要。胶原蛋白是实质性器官——基底膜的主要成分，在骨骼中超过80％的有机质就是I型胶原蛋白，I型胶原蛋白在骨骼与结缔组织中发挥作用的主要方式是形成和保持骨架的完整性；其他胶原不到20％。随着年龄的增加骨骼中无机质和有机质成分的比例也随之改变。老年人成骨细胞I型胶原形成因子合成减少，骨有机质含量降低。胶原纤维合成减少，这种为骨矿化提供框架的机械支持功能降低，使得钙盐等无机质无法沉积矿化，最终使骨吸收增加。可以说由于I型胶原的合成减少及胶原纤维的排列不足是造成骨矿化不足的基础。Ⅰ型胶原的走向也可影响骨强度，较多的纵向胶原纤维可增加抗张力强度，混合性胶原可加强抗压力强度。除此之外，胶原在形成特定的细胞外微环境中也起到主要作用，而这些微环境对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号非常关键。

除了上述的生物力学作用以外，I型胶原蛋白还有一些很重要的作用，如作为确立细胞形状及行为的信号分子、在细胞分化与发育中起重要作用等。Ⅰ型胶原蛋白分子还可以通过整合素、盘蛋白结构域受体、糖蛋白等跨膜受体向细胞内传递不断变化的外源刺激信号，从而起到信号分子的作用，与此同时，胶原蛋白还具有信号“中转站”的功能，它能够截留、贮存、运输生长因子，从而在器官发育、伤口愈合和组织修复等过程中充当重要角色。如I型胶原能结合核心蛋白聚糖，间接地阻断组织中TGF-β的作用。最近有报道称，TGF-β能增强I型原胶原的生物合成，在组织修复的病理生理过程中发挥关键作用，I型胶原蛋白间接阻断TGF-β可能是正常组织的一种反馈调节作用。

胶原纤维的作用是如此重要，以致胶原蛋白基因突变所引起的后果是非常严重的，最为常见的是成骨不全，当然还有其他，如骨质疏松、马方综合征、Ehlers-Danlos综合征等。超过90％的患有成骨不全病症的儿童都是因为Ⅰ型胶原蛋白突变引起的。严重的成骨不全的患者往往在儿童期就死去。已经发现的胶原基因的突变情况超过70种，这些突变包括基因缺失、插入突变，mRNA剪切突变，表现到胶原蛋白分子上就是胶原蛋白无法形成正确的构象或者根本就不能形成三聚体结构。

胶原蛋白不仅可以用做皮肤的护理，处理过的胶原如明胶，还可以用做食品添加剂。胶原在生长因子截获、贮存、运输等方面有很重要的作用，因此可以用做某些药物如疫苗、干扰素等生物制剂的载体，将其运送到体内，然后慢慢释放出来。胶原纤维还可以做为矫形手术材料。胶原蛋白具有生物可降解性、低抗原性及很容易获得等诸多优点，因此胶原蛋白被越来越多地用于化妆品、食品、医药等行业。然而目前胶原蛋白的来源都是动物的皮革、角、骨骼、肌腱，以及软骨组织，需要将动物宰杀以后才能得到，可能带有病原污染。生产方法也不尽如人意，主要是在破膜试剂中热处理，这样会破坏胶原分子很多原有的结构和特性。因此，无论从数量上还是质量上，都不能够满足日益增长的对胶原蛋白的需求。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可溶性高、活性高的重组人源I型胶原蛋白、编码基因、工程菌及应用。本发明利用重组技术，通过专业的软件分析和实验筛选从人的全长I型胶原基因上选取了一段长度为99bp的基因序列并对其进行9次重复，然后通过无痕克隆的方法将其构建到表达载体pET22b中。经过转化、菌液鉴定筛选出一批构建成功的质粒，再经过水溶性筛选最终选出水溶性好的含重组人源I型胶原蛋白的菌株。由于I型人源胶原蛋白与III型人源胶原蛋白各自的不同特点，将两种胶原蛋白按照一定的比例混合使用会起到更好的效果，得到一种功能更加完善的混合型胶原蛋白，应用于医疗美容，生物材料，化妆品等，这将拓宽胶原蛋白的应用领域，带来更大的市场。

本发明采用的技术方案是：