[发明专利]一种重组人源I型胶原蛋白、编码基因、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种重组人源I型胶原蛋白，其特征在于所述蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述重组人源I型胶原蛋白编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.一种由权利要求2所述重组人源I型胶原蛋白编码基因构建的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体构建的基因工程菌。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述工程菌以大肠杆菌BL21-DE3-PLySs为宿主。

6.如权利要求1所述重组人源I型胶原蛋白，其特征在于重组人源I型胶原蛋白按如下方法制备：将含重组人源I型胶原蛋白基因的工程菌接种至LB培养基，37℃培养过夜，按体积比1:100转接至新的LB培养基，在摇瓶中37℃培养至OD₆₀₀为1，加入终浓度为0.2mM IPTG，37℃培养6小时，5000g离心5分钟，收集菌体，分离提取蛋白，获得人源I型胶原蛋白。

7.如权利要求6所述重组人源I型胶原蛋白，其特征在于所述分离提取蛋白的方法为：(1)用PBS缓冲液洗涤菌体后，用1X PBS缓冲液重悬菌体制成菌悬液，加入含1mg/ml溶菌酶的Triton X-100细胞裂解液，在冰水混合物环境下超声破菌，离心，收集上清液；所述超声破菌条件为400W、2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度40℃；(2)用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱柱材，然后将柱材和上清液以体积比1:5混合，冰上轻摇30min，以2ml/min的速度上柱，用含有15mM咪唑的PBS溶液洗脱2个柱体积去除杂蛋白，加入具有His标签的PPase蛋白酶，于冰上轻摇2小时，用PBS溶液以2ml/min的速度洗脱2个柱体积，收集所有流出液加入透析袋，以PBS为透析液室温透析过夜，取截留液即为纯化RHIC9重组蛋白，冻干，获得纯化RHIC9重组蛋白干粉。

8.一种权利要求1所述重组人源I型胶原蛋白在制备胶原制剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述胶原制剂质量浓度组成为10-50％重组人源I型胶原蛋白、50-90％III型人源胶原蛋白，总量为100％。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于胶原制剂质量浓度组成为20％重组人源I型胶原蛋白、80％III型人源胶原蛋白。