[发明专利]提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法

说明书

本发明公开了一种提高2C‑like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，第一步是从小鼠ESCs培养体系中去除胎牛血清，使小鼠ESCs仍保持原有的多能性特征。第二步是利用视黄酸（RA）在不含有胎牛血清的培养液中提高小鼠ESCs中2C‑like细胞的比例，结果从对照组的0.2%提高到3.3%。本发明利用特定的诱导方法提高了小鼠ESCs中2C‑like细胞比例，并通过实验手段验证了小鼠ESCs在不含有胎牛血清的培养液中2C‑like基因表达水平和蛋白水平，对哺乳动物全能干细胞研究提供新思路。

技术领域

本发明涉及小鼠胚胎干细胞诱导培养液，尤其是一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法。

背景技术

哺乳动物合子基因组激活（ZGA）是胚胎发生的关键步骤，发生在小鼠的1-2细胞阶段和人类的4-8细胞阶段，这一阶段对于哺乳动物早期胚胎发育和全能性的形成具有重要意义。

在小鼠ESCs中含有部分（小于1%）异质性细胞，即类似2-细胞期胚胎样细胞（2C-like细胞）。2C-like细胞不仅可以表达ZGA转录本，而且具有与2细胞胚胎相似的表观遗传特征。此外，小鼠ESCs中的2C-like细胞在体内发育状态下可同时贡献胚胎和胚外组织中。所以这部分2C-like细胞是体外进行全能性干细胞研究的珍贵模型。但是到目前为止还没有在化学成分明确的培养条件下维持小鼠ESCs中的2C-like状态细胞的维持与自我更新。因此，有效提高哺乳动物ESCs中2C-like细胞比率是展开后续研究的重中之重。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，通过本方法，能够得到高比例的2C-like细胞。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案包括以下步骤：一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：

N2细胞培养添加剂 2-3 ml

B27细胞培养添加剂 4-6 ml

牛血清白蛋白 20-30 mg

非必需氨基酸 4-6 ml

左旋谷氨酰胺 4-6 ml

β巯基乙醇 0.5-2 ml

青霉素链霉素 4-5 ml

PD0325901 1.0 mM

CHIR99021 3.0 mM

白血病抑制因子LIF 500-1500 U/ml

视黄酸RA 5-15 mM

基础培养液 余量

所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。

优选，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：