[发明专利]利用RP-HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法

说明书

本发明涉及一种利用反相高效液相色谱(RP‑HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4‑羟基苯乳酸含量的方法，包括以下步骤：步骤a：配置流动相；步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4‑羟基苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4‑羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量‑峰面积标准曲线和4‑羟基苯乳酸含量‑峰面积标准曲线，得出标准曲线回归方程；步骤c：将含有苯乳酸和4‑羟基苯乳酸的样品溶液适度稀释，8000～10000r/min离心2～4min，离心后经过0.22μm微滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步骤b的标准曲线回归方程，利用内标法计算出苯乳酸和4‑羟基苯乳酸的含量。

技术领域

本发明属于高效液相色谱分析技术领域，涉及食品和发酵液中苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的快速检测，具体涉及一种利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法。

背景技术

苯乳酸和4-羟基苯乳酸是近年来微生物源生物防腐剂研究的热点之一，可以有效抑制革兰氏阴性、阳性细菌和真菌的生长，不仅用于控制食源性致病菌和腐败菌的生长，而且在调节肠道菌群方面有巨大的潜力；同时它们溶解性好，对酸碱和温度的稳定性高，故在食品行业和健康保健等领域的应用前景被人们广泛看好。

目前，苯乳酸和4-羟基苯乳酸的检测主要有薄层层析法和高效液相检测法，相关报道均以单个物质的测定较多。高效液相色谱法测定苯乳酸代表性的方法是以0.05％的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05％的三氟乙酸/水(B)的混合液为流动相，梯度洗脱程序为：0～20min由10％A线性变化至100％，20～23min保持100％A，23～25min100％A线性变化至10％；流速1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃。4-羟基苯乳酸的检测的方法为：0.05%三氟乙酸/水(A) 和0.05% 三氟乙酸/甲醇溶液(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0～20min 为10%～100% B，20～23min保持 100% B；流速: 1mL/min；检测波长: 210nm；柱温: 30℃。这两种方法中均要求梯度洗脱，对仪器配制要求高，流动相比例发生变化时，基线易发生漂移，对结果产生影响。同时流动相中三氟乙酸酸性强，对柱子的损伤大，柱子寿命严重缩短。

发明内容

针对目前苯乳酸和4-羟基苯乳酸检测时对仪器要求高、柱子损伤大、不能同时检测中两种物质等问题，本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，本发明的方法对柱子损伤小、准确度高，稳定性好，操作简单，节约成本，缩短生产过程中的检测时间，且检测结果准确可靠。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下：

利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，包括以下步骤：

步骤a：配置流动相，过滤，脱气，调节仪器，平衡色谱柱；

步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析，利用依利特离线数据处理软件进行数据处理，确定出峰时间，采用外标法，以苯乳酸和4-羟基苯乳酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量-峰面积标准曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线，得出标准曲线回归方程；

步骤c：将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品溶液适度稀释，8000～10000r/min离心2～4min，离心后经过0.22μm微滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步骤b的标准曲线回归方程，利用外标法计算出苯乳酸和4-羟基苯乳酸的含量。

其中，步骤b中，所述色谱柱为 C18 (4.6×250mm，5μm)色谱柱，色谱条件包括：