[发明专利]自主异花授粉及自主单性结实番茄的培育方法

说明书

本发明属于植物育种领域，提供了番茄自主单性结实系的培育方法和番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法等。

技术领域

本发明属于植物育种领域，具体而言，本发明涉及番茄自主单性结实系的培育方法和番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法等。

背景技术

番茄是全球消费最多的蔬菜之一，2017年产量1.82亿吨，价值超600亿美元。中国是世界上番茄栽培面积最大、生产总量最多的国家，年产量5000万吨以上。作为未来市场占据主导地位的蔬菜，番茄在生产、栽培等方面仍存在两个重大难题：1、设施栽培番茄特定环境下保产成本的限制（坐果率低，需人工点花）；2、杂交种生产过程中纯度、成本、人力的限制（柱头无外露，需人工去雄）。

而且，番茄的生长受温度影响很大，因此番茄非正常季的种植目前以设施栽培为主。而温室大棚由于温度控制不好、光照不足、缺少风或虫媒传粉等，会影响番茄受精结实，从而造成番茄大面积的落花落果，最终影响产量。在番茄种植中，一般采用以下传统途径提高坐果率：1）授粉刺激，即给番茄柱头授以不亲和花粉或无活力花粉，虽未受精但由于授粉本身的刺激可形成单性结实果；2）振动植株，即通过人工振动植株或振动花序刺激子房发育诱导形成单性结实果；3）化学诱导，即在花柄或花梗处涂抹赤霉素等激素，可以诱导番茄单性结实，也就是常说的“点花”，目前番茄种植中采用最多的是“点花法”。但是，上述所有的传统单性结实方法都具有操作复杂、单性结实率低、激素浓度难掌握、耗费人力物力等缺点，给番茄生产带来长期的困扰，并大大提高了种植成本。

本发明人经过艰苦研究，利用现代分子生物学技术，培育出番茄自主单性结实系，该系具有自主性单性结实（无需点花或授粉）、坐果率高（尤其是高低温环境）、柱头外露等性状，且无其他不良性状的产生。

在培育出番茄自主单性结实系后，本发明人继续研发，进一步培育出番茄自主异花授粉自主单性结实系，不会产生花粉且可以自主进行单性结实，需要恢复系进行常规种的繁种。另外，多数番茄天然表现为紫色茎秆，但是本发明人培育的番茄自主异花授粉自主单性结实系表现为绿色茎秆，因而可以用于在苗期快速鉴定出它。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的番茄自主单性结实系的培育方法和番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法。另外，本发明还提供了番茄自主异花授粉自主单性结实系的繁育方法以及核酸在培育番茄自主单性结实系或番茄自主异花授粉自主单性结实系中的应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了番茄自主单性结实系的培育方法，其包括：

（1）构建敲除番茄染色体上3个靶位点的载体，其中所述靶位点是核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、2和3所示的核酸；

（2）将步骤（1）获得的载体导入番茄外植体；和，

（3）培养步骤（2）获得的外植体，筛选出敲除阳性的株系。

优选在本发明第一方面的培育方法中，所述敲除的方式是通过CRISPR/Cas9技术敲除。现在已经有商用的基于CRISPR/Cas9技术的载体。在本发明的具体实施方式中，利用引物AGL6-sg-F、AGL6-sg-R、AGL6-U6-F、AGL6-U6-R2、AGL6-sgRNA-F2、AGL6-sgRNA-R、AGL6-U6-R3和AGL6-sgRNA-F3通过PCR将针对上述靶位点的核酸构建到BGK01载体上，形成敲除载体。

优选在本发明第一方面的培育方法中，所述导入的方式是农杆菌侵染。农杆菌侵染将外源基因导入植物是本领域技术人员所熟悉的。导入了外源基因的植物外植体或细胞在植物培养基上培育，出芽，生根，长成植株。