[发明专利]一种基于固相萃取的液相-液相二维色谱测定NNK及其代谢物的系统和方法

说明书

本发明涉及一种基于固相萃取的液相‑液相二维色谱测定NNK及其代谢物的系统和方法。该方法是将制备好的样品进样后通过一级色谱高效净化，切割一级色谱中NNK和NNAL流出的部分馏分，切割的馏分用稀释泵稀释降低馏分的溶剂强度，通过混合器混合后再通过固相萃取柱富集。固相萃取富集完成后，通过阀切换，用二级色谱的分析泵输送流动相，从和样品富集相反的流向把固相萃取柱上富集的NNK和NNAL洗脱下来，并通过超高效液相色谱柱分离、串联质谱检测。本发明方法可同时实现样品的高效净化和高倍数富集，方法的分析灵敏度大大提高，分析样品前处理得到了很大的简化，可准确测定血液和尿液样品中ng/L数量级的NNK和NNAL。为吸烟与健康的相关性研究提供了灵敏、准确、可靠的新方法。

技术领域

本发明一种测定NNK及其代谢物的系统，尤其是一种基于固相萃取的液相-液相二维色谱测定NNK及其代谢物的系统，还涉及测定吸烟者血液尿液NNK及其代谢物的方法，属于分析仪器领域。

背景技术

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是卷烟烟气中一类重要的有害成分，目前已报道的TSNAs有8 种，其中N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基) -1-( 3-吡啶基) -1-丁酮 (NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT) 和N-亚硝基假木贼碱 (NAB) 4 种研究较为深入。尤其是我国国家烟草专卖局将一氧化碳、氰化氢、NNK、氨、 B[a]P、苯酚和巴豆醛7种成分最为表征卷烟烟气危害性的指标，并对其在卷烟烟气中的含量作限量控制后，NNK的研究在国内引起了极高的关注。

目前国内NNK的研究主要限于卷烟烟气中NNK的检测及降低技术，相关吸烟者血液和尿液中NNK测定及其代谢研究相对较少。NNK的致癌性来源于体内代谢活化过程。NNK发生羰基还原反应生成4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)，NNK和NNAL进一步发生α-羟基化反应，其产物可以与DNA反应生成DNA加合物，呈现致癌活性。因此NNK及其稳定代谢产物NNAL的准确测定对于深入研究吸烟与健康的相关性非常重要。

关于NNK及代谢物NNAL的检测，文献报道多采用[5-³H]NNK标记，HPLC 法分析。近年来，HPLC-MS/MS 因其具有较高的灵敏度和选择性，被广泛应用于TSNAs及其代谢物的检测中，尤其是在生物复杂基质中，例如微粒体、尿液、血液等。但吸烟者血液和尿液中的TSNAs及其代谢产物含量极低，仍需要对样品进行高倍数的富集和干扰物分离后才能测定。目前TSNAs及其代谢产物分析常用的样品前处理固相萃取或柱层析分离净化，该类方法净化样品需多次的浓缩、转移，操作繁琐；而且还会因在敞开环境中大量使用有机溶剂而污染环境，对实验操作人员的健康危害大。

发明内容

针对上述存在的技术问题，本发明中构建了一种基于固相萃取的液相-液相二维色谱测定NNK及其代谢物的系统和方法。在所述方法中，吸烟者血液和尿液样品可直接进样分析，大大简化了样品前处理操作步骤，提高了分析结果的精密度；该方法还能显著减少前处理过程中有机溶剂用量，大大降低了样品前处理过程中有机溶剂向环境中的散发，从而减少了样品处理过程中的环境污染。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于固相萃取的液相-液相二维色谱测定NNK及其代谢物的系统，包括一级色谱系统和二级色谱系统，一级色谱系统与二级色谱系统之间通过六通阀连接；固相萃取柱设于六通阀上；一级色谱系统包括进样器，进样器一端与第一泵连接，另一端与净化柱连接，净化柱一端检测器连接，检测器一端与三通阀一端连接，三通阀的该端还与第二泵连接，三通阀的另外两端一端为废液出口，另一端连接混合器；第二泵将NNK和NNAL流出部分馏分切割进入固相萃取富集，其余部分则流入废液；二级色谱系统的第三泵与六通阀其中一口连通，另一口与二级色谱系统的分析柱连接，分析柱与检测器连接。

进一步地，六通阀上设有七个口，分别为第一口至第七口，混合器一端与第七口连通，固相萃取柱两端与第一口和第四口连通。