[发明专利]提高比活的α-淀粉酶突变体BasAmy-2及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高比活的α‑淀粉酶BasAmy突变体及其编码基因和应用。所述突变位点为：氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的α‑淀粉酶BasAmy发生以下突变：L29A，L269F，S270P，A275Y，Q278S，S279Q，D356G和L412C。本发明获得的突变体的比活较原酶提高。

本申请是以下发明专利申请的分案申请(申请号：2017100308497，申请日：2017-01-16，发明名称：提高比活的α-淀粉酶BasAmy突变体及其编码基因和应用)

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高比活的α-淀粉酶突变体BasAmy-2及其编码基因和应用。

背景技术

α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，能够从淀粉分子内部随机切开α-1,4糖苷键生成糊精和还原糖。α-淀粉酶广泛应用于食品工业、酿造、发酵和纺织品工业。

α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。相对于其他来源的α-淀粉酶，微生物来源的α-淀粉酶作用温度广，pH值范围广，生产成本低，因此微生物来源的α-淀粉酶被广泛的应用于各个工业领域。作为微生物α-淀粉酶中最重要的一类，芽孢杆菌α-淀粉酶是目前研究和应用最为广泛。

沙漠芽胞杆菌(Bacillus sonorensis)α-淀粉酶简称BasAmy，是一种中温α-淀粉酶，其作用pH广，适用于食品、造纸、饲料等工业领域。相对于其他芽孢杆菌α-淀粉酶，BasAmy比活低，生产成本高，限制了其在食品、造纸、饲料等工业领域的应用。因此，提高BasAmy的比活，降低其生产成本，是BasAmy工业化应用急需解决的问题。

发明内容

本发明对来源于索诺拉沙漠芽胞杆菌的α-淀粉酶BasAmy进行分子改造，从而提高BasAmy的比活，降低生产成本，为α-淀粉酶BasAmy的工业化应用奠定基础。

本发明的目的是提供提高比活的α-淀粉酶BasAmy突变体。

本发明的再一目的是提供提高比活的α-淀粉酶BasAmy突变体的编码基因。

索诺拉沙漠芽胞杆菌的α-淀粉酶BasAmy的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.6所示。

本发明采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.6所示的α-淀粉酶BasAmy的第29位、第267位、第270位、第275位和第350位进行分子改造，经过高通量筛选确定了第29位、第267位、第270位、第275位和第350位这5个位点的最优突变氨基酸。其中29位由L突变为A最好，267位则是S突变为Q，270位则是S突变为P，275位则是A突变为Y，350位则是D突变为G。

同时采用易错PCR技术对SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶BasAmy的核苷酸序列进行改造，从而获得一系列的突变位点。经过高通量筛选获得了6个有效突变体分别为A112R，L269F，K274S，Q278S，S279Q和L412C。

在上述有效突变位点的基础上，分别一一进行组合，最终得到了四个提高比活的Bsamy突变体分别命名为BasAmy-1、BasAmy-2、BasAmy-3和BasAmy-4。这四个突变体的相对比活分别是BasAmy的130％，160％，180％和125％。BasAmy-1、BasAmy-2、BasAmy-3和BasAmy-4突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2到SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.7到SEQ ID NO.10所示。

其中BasAmy-1包含的突变位点为L29A，A112R，S267Q，K274S，Q278S，S279Q，D356G和L412C。

其中BasAmy-2包含的突变位点为L29A，L269F，S270P，A275Y，Q278S，S279Q，D356G和L412C。