[发明专利]一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型

说明书

本发明提供了一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型。本发明基于无标记细胞整合药理学技术，利用α2A肾上腺素受体稳定表达的细胞系，建立了筛选α2A肾上腺素受体的激动剂和拮抗剂的方法。此方法还可以用于研究影响α2A肾上腺素受体下游通路的调节剂。本发明构建的α2A肾上腺素受体细胞筛选模型不需要荧光标记且检测过程无需额外添加指示剂，具有无标记、无伤害、高通量、高灵敏等特点。其用于从天然产物库、代谢产物库及组合化学库中寻找α2A肾上腺素受体的激动剂、拮抗剂和通路活性分子或者活性化合物，及α2A肾上腺素受体参与的镇痛、镇静、缺血性心脏病、脓毒性心脏病和调节血压的药物筛选。

技术领域

本发明涉及细胞筛选领域，具体涉及一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型。

背景技术

肾上腺素能受体是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，为G-蛋白耦联型。G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor, GPCR）是细胞信号传导中最重要的一类膜受体。根据其对去甲肾上腺素的不同反应情况，分为肾上腺素能α受体和β受体。相对来说去甲肾上腺素对于α受体的作用较肾上腺素更为敏感，而肾上腺素对β受体的作用会更敏感。α受体分为α1受体和α2受体。α2受体是一类重要的GPCR受体，根据其末端氨基酸不同，分为α2A，α2B，α2C共3个亚型。

α2A是一种重要的GPCR，研究证明其与很多疾病相关。杨志芳等人通过构建CHO-α2A细胞和基因敲除模型动物，证明α2A受体在镇痛、镇静和调节血压中发挥重要作用；王华东等人发现阻断盲肠结扎穿孔小鼠的α2A受体可明显改善小鼠生存和心功能， 并且减少心脏细胞凋亡，证明α2A受体在脓毒性心脏病中发挥重要作用。但是目前缺少可以高通量检测α2A受体的高效模型。因此，构建选择性α2A受体筛选模型，以发现α2A受体的内源性配体、高活性激动剂、拮抗剂及通路调节剂，对发现高选择性α2A药物有潜在的价值。

目前受体的高通量筛选方法主要有传统的放射配体结合技术、FLIPR、WesternBlotting 等。这些方法都有一定的局限性，如FLIPR虽然可以高通量检测成分，但是其染料价格昂贵，且步骤繁杂；Western Blotting通量低，步骤繁琐，周期长，实验结果不稳定，不易于定量等不足，影响筛选结果的可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型，以高通量筛选α2A受体激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及α2A受体参与的镇痛、镇静、缺血性心脏病、脓毒性心脏病和调节血压的药物筛选应用。

本发明的技术方案为：

基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达α2A的细胞系HEK-293-α2A，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立α2A受体的细胞筛选模型。根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性或者下游通路的调节影响。

所述的无标记细胞整合药理学技术是将细胞受药物刺激产生的动态质量重置(dynamic mass redistribution, DMR)经谐振波导光栅生物传感器记录为可视化谱线，从而反映药物作用靶点和通路。无标记细胞整合药理学技术主要通过激动、脱敏和拮抗三个实验来确认活性结果。

一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型的建立过程为：

1）在具有谐振波导光栅生物传感器功能的384微孔板中接种HEK-293-α2A细胞，接种的细胞密度为2.0 ~ 2.5 × 10⁴个/孔，细胞培养液体积为40 µL/孔，接种后细胞培养时间为18 ~ 24 h。

2）将无选择性肾上腺素受体激动剂肾上腺素以浓度为1.2 ~ 10000 nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；