[发明专利]能够满足谷子杂交种纯度鉴定要求的单粒醇溶蛋白提取方法

说明书

本发明公开了一种能够满足谷子杂交种纯度鉴定要求的单粒醇溶蛋白提取方法，所采用的醇溶蛋白提取液具有如下组份：NN‑二甲基甲酰胺10体积份，蔗糖20重量份，异丙醇50体积份，去离子水补充提取液到100体积份；并在醇溶蛋白的提取过程中，控制提取温度为65℃。本发明的方法建立了一套适用于谷子单粒醇溶蛋白提取方法，为开展谷子杂交种的纯度鉴定、品种管理以及大面积推广研究提供了有力的技术支持。

技术领域

本发明涉及植物醇溶蛋白提取技术，具体涉及一种单粒谷子种子醇溶蛋白提取方法。

背景技术

20世纪90年代以前，谷子杂交种鉴定主要通过父母本苗色的差别，选用苗色深的常规材料做父本，以苗色较浅的不育系为母本，依据深颜色对浅颜色为显性的遗传规律，杂交种与父本颜色相同，通过拔除杂交种中混杂的颜色较浅的母本，去除杂株，也通过调查其中颜色较浅的不育株的比例确定杂交种的纯度，这一方法虽然能去除杂交种中的部分杂株，但限制颜色较深的不育系的应用，且费工费时，不能去除杂交种中混杂的恢复系和其它材料，鉴定的纯度也不准确。20世纪90年代以后，随着抗除草剂材料的引进、创制成功，通过培育抗除草剂的恢复系，而不育系不抗除草剂，利用抗除草剂性状显性遗传的特点，通过苗期喷施除草剂杀除其中假杂种，来鉴定杂交种的纯度、去除假杂种，这一方法，使各种苗色的不育系均能获得应用，但也不能鉴定出杂交种混杂的恢复系或其它抗除草剂材料，仍不能彻底去除杂交种中的假杂种，也不能准确的鉴定杂交种的纯度。因此，创造一种能够准确鉴定杂交种纯度的方法成为对谷子杂交种进行品种管理、保证其增产效果的当务之急。

利用分子标记构建每个品种的指纹图谱，是目前常用的作物杂交种乃至品种纯度、甚至真假鉴定的常用方法，但是这种方法需要使用较多的典型引物，且要求引物多态性较好，否则，构建的品种的指纹图谱不够准确，也难以准确的鉴定杂交种的纯度，同时该方法需要经过育苗、DNA提取、电泳、读带等过程，操作复杂，鉴定时间长，不适合大批量的进行杂交种纯度鉴定。

醇溶蛋白是禾本科作物种子中的一种主要的贮藏蛋白，是种子萌发时C和N的主要来源^[1,2]。其电泳带谱完全受基因型控制，不受环境条件影响，且遗传变异丰富,在品种间存在着稳定的多态性，可作为品种的“指纹”^[3]。同时，其多态性检测不需要育苗、DNA提取、聚合酶链式反应等环节，操作简单，已在小麦、水稻等作物品种鉴定、纯度分析、种质资源的鉴定评价、物种遗传多样性研究等方面广泛应用^[4]；国际种子检验协会已把小麦醇溶蛋白带谱鉴定作为标准方法用于小麦种子的纯度鉴定^[5]，因此，醇溶蛋白在品种的真假和纯度鉴定中的作用越来越受到科研人员的重视。

关于玉米、高粱、小麦、大麦、水稻的醇溶蛋白提取方法已有一些报道^{[6,7,8,9,10,11,12]}，与上述作物相比，谷子的醇溶蛋白分子量小、粒小，千粒重2.5g左右，仅为小麦、高粱、水稻的1/10-1/20左右，比玉米更小，提取难度更大，上述作物醇溶蛋白提取方法很难直接用于谷子醇溶蛋白的提取，更不能用于谷子单粒醇溶蛋白的提取，因此，欲开展利用谷子醇溶蛋白鉴定杂交种纯度的技术体系，必须先开展单粒法谷子醇溶蛋白提取技术研究，首先要根据谷子醇溶蛋白的特点，探明适宜谷子醇溶蛋白提取的试剂及建立适宜谷子醇溶蛋白的提取体系、反应条件。而谷子醇溶蛋白的突出特点是分子量小、且仍存在较大差别，在14kDa--66kDa之间，要建立适宜单粒谷子的醇溶蛋白提取技术，首先要筛选、组配出能够很好的溶解含有分子量不一的醇溶蛋白谷子粉末的有机溶剂；其次，要筛选、增加能凝聚蛋白的试剂，创造适宜它们发生反应的环境条件，彻底提取谷子籽粒中的醇溶蛋白。