[发明专利]一种调控大肠杆菌细胞大小的方法

说明书

本发明公开了一种调控大肠杆菌细胞大小的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过缺失碳储存调节因子的编码基因csrA和过表达组氨酸类似物与绿色荧光蛋白的融合蛋白基因hns‑gfp来调节大肠杆菌的细胞大小。结果表明，大肠杆菌在缺失碳储存调节因子基因和过表达组氨酸类似物与绿色荧光蛋白融合蛋白的基础上，通过控制诱导剂浓度可以实现大肠杆菌细胞大小的调控，与出发菌株相比，在不同的无水四环素(aTc)诱导下，大肠杆菌细胞大小可增加1379％。这为调控大肠杆菌细胞大小提供了一种新策略。

技术领域

本发明涉及一种调控大肠杆菌细胞大小的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)由于其遗传背景清晰、基因操作手段成熟、具有较好的兼容性和快速生长优势，在代谢工程和合成生物学方面已经成为目前应用最广泛的宿主菌。同时，大肠杆菌也用于生产聚合物，例如聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚β羟基脂肪酸酯(PHB)等。

在发酵生产聚合物的过程中，胞内聚合物积累，会占据细胞内空间，严重影响细胞生长，从而降低聚合物的产量。大肠杆菌细胞形态微小，这不仅限制了聚合物的积累，而且增加了产品的分离成本。因此，有效地增加细胞大小是利用大肠杆菌生产聚合物过程中一个亟待解决的问题。目前，增加大肠杆菌细胞大小的方法主要是通过调控细胞壁的形成、调控肽聚糖的形成以及调控细胞分裂，但是这些方法在调控细胞大小的同时会导致细胞生长下降，同时该方法无法调整内含物在细胞中的分布。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种调控大肠杆菌细胞大小的方法，在细胞培养过程中添加诱导剂，调节诱导剂的浓度以调节大肠杆菌细胞大小；所述大肠杆菌中不表达碳储存调节因子，且过表达组氨酸类似物与绿色荧光蛋白的融合蛋白；所述不表达包括缺失或沉默。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂包括无水四环素。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达是：采用四环素诱导型启动子转录编码组氨酸类似物与绿色荧光蛋白融合蛋白的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂的浓度为0～150ng/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述碳储存调节因子的氨基酸序列与NCBI上accession number:947176的基因编码的氨基酸序列一致。

在本发明的一种实施方式中，所述组氨酸类似物的氨基酸序列与NCBI上accession number:945829的基因编码的氨基酸序列一致。

在本发明的一种实施方式中，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列与NCBI上accession number:MK816963的基因编码的氨基酸序列一致。

在本发明的一种实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)JM109。所述Escherichia coli JM109是在TaKaRa上购买的大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述不表达碳储存调节因子具体是：

(1)根据Escherichia coli K-12中的csrA基因(NCBI accession number:947176)3`和5`端45bp序列设计携带有csrA同源臂的引物，采用PCR技术，以pKD4质粒为模板，扩增出含有csrA同源臂带有卡那霉素抗性基因的敲除框；

(2)将上述敲除框导入含有pKD46质粒的大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述组氨酸类似物与绿色荧光蛋白融合蛋白的过表达具体是：