[发明专利]一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，电化学免疫传感器的制备包括以下步骤：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；

（2）铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜是利用400 µL铂纳米粒子和2 mL的2.0 mg/mL氧硫铟化铜室温下振荡24 h，离心，溶解于2 mL的去离子水；

（3）将6 µL、浓度为1.0 ~ 3.0 mg/mL的铂纳米粒子功能化氧硫化铜溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（4）继续滴涂6 μL、浓度为10 μg/mL的降钙素原抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）继续滴涂3 µL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）继续将6 µL、浓度为1.0 fg/mL～50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

其中，花状氧硫化铜的制备步骤为：

在磁力搅拌的条件下，将4.0 g～5.0 g 三水合硝酸铜加入到500 mL水溶液中；再将1.0 g~2.0 g硫代乙酰胺加入到500 mL溶液中；30 min后，将该溶液加热到90 ºC；接下来再加入0.1～0.2 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体，用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物；将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h，研磨后得到花状氧硫化铜纳米材料；

铂纳米粒子的制备步骤为：

铂纳米粒子是通过将四氯铂酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的；将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮，40 mg～60 mg的抗坏血酸和400 mg～600 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC，并且保持10 min；然后用滴管逐滴加入含40mg～60 mg的四氯铂酸钾的3.0 mL水溶液中，并且将这一反应在80 ºC保持3 h，洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中；

铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜纳米材料的制备步骤为：

将400 µL的铂纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化铜溶液中，在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的铂纳米粒子，再分散于2 mL去离子水中得到铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜溶液。

2.如权利要求1所述的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述的1.0 fg/mL～50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液为1 mg/mL的降钙素原溶液用磷酸盐缓冲溶液稀释得到。

3.如权利要求1所述的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，降钙素原的检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH 为4.0～9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；

（2）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位为-0.6~0.2 V，扫描速率设置为0.1V/s；

（3）使用含10 µL浓度为5 mmol/L过氧化氢的10 mL磷酸盐缓冲溶液作为底液，通过计时电流方法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学电流信号强度；所述磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4，用0.1 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制；

（4）根据所得电流差值与降钙素原浓度呈线性关系，绘制工作曲线；

（5）依据工作曲线的绘制方法进行样品中降钙素原的检测，检测结果从工作曲线中查得。