[发明专利]含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体及其构建方法

说明书

一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示，命名为PBI121‑CmACO‑GFP，是先获取表达载体pCAMBIA1304中报告基因GFP片段，与pBI121质粒连接，获得pBI121‑GFP质粒；再通过CmACO基因的同源克隆，获取CmACO基因的全长cDNA序列和CmACO基因ORF区全长序列；最后，获取CmACO基因全长ORF片段，与pBI121‑GFP质粒连接，得到。本发明的含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体同时具有荧光特征和组织化学底物特征，能弥补单个GUS或GFP报告基因在研究应用上的缺陷。将本过表达载体转化至菊花中将致使菊花中ACO基因过量表达，从而提高菊花中乙烯的水平，促进菊花苗的生长发育，缩短其由营养生长转向生殖生长的时间，进而缩短菊花的种植周期，大大降低种植成本。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，同时涉及该过表达载体的构建方法。

背景技术

乙烯是一种气体激素，它的结构十分简单，能够任意出入细胞膜。对于植物生长、发育有重要作用。该激素能调节植物器官的老化与脱落，还能促进果实的成熟，并且在逆境胁迫和病原菌侵染条件下，植物中的乙烯合成量会增加，将植物自身的防卫反应激活，可见乙烯是植物逆境胁迫中的重要激素。

ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO)，又称乙烯合成酶(ethylene-formingenzyme,EFE)，是催化乙烯生物合成途径的最后一步(即催化ACC生成乙烯)的关键酶，控制着乙烯的生成速率。近年来的研究表明，ACO基因家族的特异表达，不论是在果实成熟和花器官发育过程，还是在植物营养器官的生长发育过程，对乙烯生物合成的调节都是十分重要的，如：Picton等应用反义RNA技术转移ACO基因，转基因番茄植株果实中乙烯比对照组下降了90％，在转色期采收的果实3个星期才能变红，而对照组只用7d，并且转基因果实一旦变红后，并不像正常果实过熟那么快，在室温条件下可放130d。Ayub等将反ACC氧化酶基因转入甜瓜中，也获得了与番茄类似的结果，果实中乙烯合成减少99.5％，成熟明显被推迟，果实表现出较好的抗性和耐储性。Savin等利用ACC氧化酶基因的反义RNA技术抑制康乃馨乙烯释放，从而延缓花瓣的衰老取得成功。此外，植物中有时还需要提高乙烯的含量，一个ACO的过表达构建是最合适的。如：在红花中，ACO1过表达可刺激类黄酮的生物合成途径，对油籽的生产具有重要意义。ACO1在杨树中过表达会刺激形成层细胞分裂，进而导致木质部发育增加，抑制伸长生长，这是木材行业的理想特性。ACO基因是高度保守的，金勇丰等采用PCR和RT-PCR技术成功地从“玉露”桃基因组DNA、成熟果实、叶片伤诱导cDNA中扩增克隆出ACC氧化酶基因，该基因全长1288bp，编码319氨基酸，与番茄ACC氧化酶基因eth1、矮牵牛ACO1、康乃馨pSR120氨基酸序列同源性分别为83％、76.8％、74％。因此，ACO基因在不同物种中可能具有相似的功能。

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是植物分子生物学研究最为常用的2个报告基因，广泛应用于转基因、启动子分析以及基因表达调控研究。它们在使用上各有特点，在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。报告基因的选择取决于实验研究目的、性质以及分析方法上的可行性，但单个报告基因往往存在不足，植物分子生物学目前已重视多个报告基因的联合使用。如，GUS一般用来做植物组织定位，比如说根、茎、叶部位；GFP可以用来做亚细胞定位，通过共聚焦显微镜可以观察基因在细胞内哪些位置表达，比如说定位在线粒体、叶绿体、或者核内等等。为建立一个简单快速、可定性定量检测植物启动子活性的报告基因表达系统，融合GUS::GFP报告基因在不同植物中高效表达，其融合蛋白同时具有荧光特征和组织化学底物特征，弥补了单个GUS或GFP报告基因在研究应用上的缺陷。