[发明专利]一种控制细胞黏附和脱离的细胞培养材料及制备方法

说明书

本发明公开了一种控制细胞黏附和脱离的细胞培养材料及制备方法，该材料以2‑正丙基‑2‑噁唑啉为原料，经单体开环聚合、侧链水解与修饰制得，通过简单酰胺化接枝到基底表面能够用于大规模细胞培养。本发明采用的原料，合成简单，价格低廉，所得材料无毒无害，且生物相容性好，在接枝过的基底上培养细胞时，能够仅通过降低培养基温度就可促使细胞从基底上自动脱落，避免使用胰酶，减少细胞损伤，最大限度保留了细胞活力，在大型细胞生产、组织修复以及干细胞收获过程中有重大应用价值。

技术领域

本发明涉及细胞材料制备领域，具体涉及一种控制细胞黏附和脱离的细胞培养材料及制备方法。

背景技术

在组织工程和生物医学工程中，大量生产种子细胞的方法是在体外多次培养和收获干细胞。近来发现，不依赖贴壁的细胞，例如：脂肪干细胞(ADSC)、间充质干细胞(MSC)和胚胎干细胞(ESC)，也能够在细胞培养基底上粘附生长，由于细胞贴壁十分紧密，从而导致分离困难。目前最常用的细胞分离方法包括酶消化和机械解离，但反复使用酶消化和机械解离会引起传代细胞干性逐渐丧失，其中酶消化通过去除细胞粘附所需的表面蛋白和离子使细胞脱落，这便是造成细胞干性丧失的主要原因。因此需要寻找新的细胞收获方法，来弥补当前技术的不足。

聚(2-正丙基-2-噁唑啉)是一种热响应性高分子材料，经其修饰过的基底在温度高于聚合物浊点时，表面相对疏水，温度低于聚合物浊点时，表面相对亲水。利用细胞在疏水表面(温度高于浊点)上粘附生长，从亲水表面(温度低于浊点)上自动分离的性质，仅通过降低培养温度就可以从培养基底上分离出完整的细胞。此外，聚(2-正丙基-2-噁唑啉)具有无毒、生物相容性优异、体内排出速率快、无组织积累等特点。聚(2-正丙基-2-噁唑啉)与蛋白质或小分子药物偶联后仍能够保持其活性，并可以嫁接到脂质体双层上或配制成胶束载体以及涂覆在防污装置的表面上。当将不同的基团(侧链或末端)引入聚合物链时，聚(2-正丙基-2-噁唑啉)的化学结构及其特性可以自由的调控，另外通过加入其他具有不同侧链长度的单体，可以精确调节聚合物的浊点温度，这使它成为细胞非胰酶收获技术的理想选择。

发明内容

技术问题：本发明目的在于提供一种控制细胞黏附和脱离的细胞培养材料及制备方法，该材料能够在收获细胞时最大限度的保留细胞外基质，以解决细胞收获中使用酶消化和机械解离所造成的细胞损伤问题。

技术方案：本发明是一种控制细胞黏附和脱离的细胞培养材料及制备方法，使用2-正丙基-2-噁唑啉为单体，聚合得到聚(2-正丙基-2-噁唑啉)，通过酸催化水解部分侧链，并使用丁二酸单甲酯酰氯官能化，碱性水溶液水解酯键，酸化得到羧酸官能团，随后接枝到胺化二氧化硅玻片表面。

上述一种控制细胞黏附和脱离的细胞培养材料及制备方法，包含以下步骤：

步骤一：氮气氛围下，将2-正丙基-2-噁唑啉加入到无水乙腈，再加入三氟甲磺酸甲酯作为引发剂，引发剂与2-正丙基-2-噁唑啉的摩尔比为1：100～1：300，在50-80℃下反应进行3～7天，使用0.1～0.5wt％氢氧化钠的甲醇溶液终止，旋干溶剂，产物聚(2-正丙基-2-噁唑啉)溶于水，透析3-5天，冻干得到白色固体；

步骤二：聚(2-正丙基-2-噁唑啉)以0.1～0.5g/ml溶于甲醇中，加入浓盐酸，在80～100℃下反应30～90min，随后旋干，加入氢氧化钠将pH调至碱性，再次旋干，将剩余物溶于二氯甲烷并过滤，随后向乙醚中沉淀，产物为聚(乙烯亚胺-co-2-正丙基-2-噁唑啉)，真空烘干；

步骤三：将所述聚(乙烯亚胺-co-2-正丙基-2-噁唑啉)溶于二氯甲烷，加入丁二酸单甲酯酰氯，随后滴加三乙胺，反应3～5小时，过滤并向乙醚中沉淀，所得固体烘干，溶于稀的氢氧化钠溶液，水解一段时间，加入盐酸将pH调至酸性，在水中透析3～5天，冻干得到聚[(2-正丙基-2-噁唑啉)—COOH]白色固体；