[发明专利]基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及应用

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas13的RNA编辑系统及其应用，所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件；其中，所述靶向元件包含刺激响应蛋白A和失活型Cas13酶（dCas13），所述编辑效应元件包括刺激响应蛋白B和RNA编辑效应蛋白；所述刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B在刺激作用下相互结合，刺激消失后解除结合；本发明首次提出了光控RNA编辑的概念，将光遗传学与RNA编辑相结合，构建了基于CRISPR‑Cas系统的光控RNA编辑系统，实现了RNA编辑的精准时空调控，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因编辑方法，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及其应用。

背景技术

核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，在生命过程中发挥至关重要的作用，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。表观转录组学（Epitranscriptomics）是近来兴起的热门领域之一，主要研究RNA所携带的化学修饰对基因表达的影响。迄今为止，在RNA上已发现了一百多种化学修饰。这些修饰大量分布在非编码RNA，特别是rRNA，tRNA和snRNA上，为ncRNA在翻译与剪接中发挥正常功能所必需。其中m6A（N6-methyladenosine）及A-to-I （inosine）是最常见的两种RNA修饰方式，这些修饰也分布在真核生物mRNA上，影响mRNA的代谢与功能。特别是伴随着许多mRNA修饰酶（Writer）、去修饰酶（Eraser）和修饰识别蛋白（Reader）的新发现，mRNA化学修饰的可逆变化与动态调控重新激起了研究人员的兴趣，受到越来越多的关注。尽管RNA修饰对于其功能有重要影响，但目前尚无有效的方法对特定基因的化学修饰进行精准调控。

转录后调控对于基因表达的精准协作起到至关重要的作用，目前能够对RNA进行编辑的方法主要包括：

1. 基于CRPSR-Cas系统的方法。Cas9被广泛用于基因组DNA的编辑，它具有DNA酶的活性但不具备RNA酶活性。近期有学者对Cas9系统进行改进，通过引入一段短的DNA寡核苷酸与目的RNA序列结合，从而产生Cas9发挥功能所必须的PAM序列，使得Cas9能够识别并作用于单链RNA（1）。通过进一步优化该系统，Cas9能够用于内源性mRNA的示踪，抑制mRNA的翻译等（2）。目前研究发现Cas13主要包括Cas13a， Cas13b及Cas13d。其中Cas13a是首个发现以RNA作为向导具备靶向RNA酶的CRISPR-Cas系统，它具备单链RNA识别及剪切的功能。Cas13d特点为分子量在四者间最小（930个氨基酸组成），便于慢病毒及腺相关病毒的包装，同时具备更显著的RNA敲低效果。Cas13b目前被用于进行靶向RNA编辑。Cox等研究者将失活的Cas13b（dCas13b）与ADAR2融合，从而实现了活细胞内特定位点的RNA编辑（3）。Rauch等人将dCas13b与m6A识别蛋白（YTHDF1和YTHDF2）相融合从而能够研究m6A修饰对于特定转录本的影响（4）。近期Xiao-Min Liu等基于CRIPSR-Cas9系统开发了特定RNA m6A编辑的新工具。研究者将失活的Cas9（dCas9）与m6A甲基化酶及去甲基化酶分别融合，然后连同向导RNA及短链DNA寡核苷酸（与RNA碱基互补配对结合形成PAM序列）共同导入细胞内，能够实现细胞内特定位点的RNA m6A编辑（5）。但该方案无法实现特定RNA修饰的时空调控，CRISPR系统导入细胞内后会持续发生作用，这无法满足复杂生物学行为的精准调控要求。2、基于RNA结合蛋白的方法。RNA结合蛋白对于RNA的调控及代谢至关重要，它能够通过识别RNA中特定的结构域并与之结合。PUF是人源Pumilio 1（PUM1）蛋白的RNA结合结构域截短体。PUF蛋白以特定方式识别其RNA靶点。利用PUF的这种RNA识别、结合功能，将其与各种功能模块融合在一起，能够发挥不同的特异性功能。近期报道的CIRTS （CRISPR-Cas-inspired RNAtargeting system）系统，由单链RNA结合蛋白ORF5，HBEGF，b-defensin3，RNA发卡结构结合蛋白TBP，SLBP及不同的效应蛋白（Pin核酸酶，YTHDF1，YTHDF2，ADAR2）组成，该系统体积小，无免疫原性，可操控性强，为研究RNA修饰提供了一个简便的平台（6）。