[发明专利]可定向诱导的、抗凋亡的多能干细胞及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种可定向诱导的、抗凋亡的多能干细胞及其制备方法与应用，利用基因修饰技术，将Tet‑On系统和抗凋亡基因Bcl转入hiPSC中，建立可定向诱导为运动神经元的hiPSC。所得多能干细胞既保留了hiPSC本身来源广、增殖快的优点，又保证了干细胞分化方向的可控性及移植后细胞在体内的存活数量，解决了干细胞移植安全性和有效性问题。同时，本发明方案能够为ALS及其它神经退行性疾病的治疗奠定了基础。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种可定向诱导的、抗凋亡的多能干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

退行性疾病通常伴随特定神经元的病变或损伤，其中肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)患者主要是由于运动神经元的广泛死亡。由于神经元的不可再生性，目前的治疗方法均无法逆转神经损伤。干细胞可以分化为相应神经细胞以替代受损神经元，修复神经环路，因此能够应用于神经退行性疾病的修复治疗。早在2001年，Mazzini等人首次在临床试验中，证实了间充质干细胞在ALS病人身上具有较高的安全性和耐受性^[1]。随后，越来越多的临床研究指出，移植间充质干细胞可以降低运动神经元的退化速度，调控细胞因子的分泌，抑制神经炎症反应，进而改善ALS患者的临床症状，提高患者的生存质量^[2,3]。尽管间充质干细胞移植在临床试验中安全性高、耐受性好，但其治疗效果偏弱，可能原因是间充质干细胞并不能嵌入病人的脊髓中，整合和分化为运动神经元，很难实现干细胞替代损伤神经元的目的。

因此，一些科学家直接将已分化完成的运动神经元移植到动物体内中进行研究。其中，Wichterle等人将胚胎干细胞(embryonic stem,ES)分化的运动神经元注射到鸡胚(15-17d)的脊髓中，发现分化的运动神经元可以大量存活，并延长轴突至肌肉处，形成神经肌肉接头^[4]。此外，Harper等人把ES分化的运动神经元注射到截瘫的大鼠腰椎中，发现分化的运动神经元可延伸轴突长度，形成神经肌肉接头，并重新支配麻痹的肌肉组织^[5]。但是，该方法只适用于截瘫这样的静态模型，对于不断恶化、预后极差的ALS并没有效果^[6]。并且，神经元分化过程复杂、成本高、耗时长(1个月以上)、效率低(20％-50％)，且不能增殖，严重的限制了其临床应用^[7]。

诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)是近年来干细胞领域中具有里程碑意义的突破。尤其是通过异位表达几个与维持ES多潜能性相关的关键性核转录因子(如c-MYC、KLF4、OCT3/4、SOX2等)使体细胞发生重编程，为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径。该方法操作简单且避免了使用ES的伦理问题，是组织工程、再生医学、疾病模型和药物筛选的理想种子细胞，因此，具有广阔的临床应用前景。

iPSC增殖快、来源广、分化潜能高，且相对于ES无伦理学争议，但以iPSC 为基础的治疗仍然面临两大难题：一方面iPSC具有成瘤倾向，安全性受到极大的挑战；另一方面移植细胞在体内不易存活，且分化方向不可控制，导致其有效性也得不到保障。且目前关于运动神经元的定向分化大多数限于体外研究，而关于基因修饰后的iPSC能否在体内定向高效分化为运动神经元，及其对ALS发挥治疗作用，尚未可知。

参考文献：

[1]Mazzini L,Fagioli F,Boccaletti R,Mareschi K,Oliveri G,Oliveri C,Pastore I,Marasso R,Madon E.Stem cell therapy in amyotrophic lateralsclerosis:a methodological approach in humans[J].Amyotrophic LateralSclerosis and Other Motor Neuron Disorders,2003,4(3):158-161.