[发明专利]用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物

说明书

本公开内容涉及基因组工程领域，特别是细胞的基因组的靶向修饰。

相关申请的交叉引用

本申请主张2013年10月17日申请的美国临时申请No.61/892,348和2014年8月5日申请的美国临时申请No.62/033,424的权益，所述申请的公开内容以其全文引用的方式并入本文。

技术领域

本公开内容涉及基因组工程领域，特别是细胞的基因组的靶向修饰。

发明背景

已描述用于基因组DNA的靶向切割的各种方法和组合物。可使用这些靶向切割事件，例如，引起靶向突变，引起细胞DNA序列的靶向缺失，及促使在预定染色体基因座靶向重组。参见，例如，美国专利No.8,586,526；8,329,986；8,399,218；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960及美国申请No.14/278,903，所述专利申请的公开内容针对所有目的以其全文引用的方式并入本文。

这些方法通常涉及使用工程改造的切割系统以引起双链断裂(DSB)或靶DNA序列缺口，因此，通过产生错误的过程诸如非同源末端连接(NHEJ)修复断裂或使用修复模板(同源导向的修复或HDR)修复可导致基因敲除或受关注的序列插入(靶向整合)。可通过使用特定核酸酶诸如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，使用以工程改造的crRNA/tracr RNA(‘单导向RNA’)导引特定切割的CRISPR/Cas系统和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如，从高度好热菌得到，称为‘TtAgo’,(Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)，进行切割。

使用一种上述核酸酶系统的靶向切割可采用HDR或NHEJ介导的过程中任何一种过程用于将核酸插入到特定靶位置。然而，将核酸酶系统和供体同时递送到细胞可能是问题所在。例如，通过转导质体进入到细胞中来递送供体或核酸酶可能对受体细胞，尤其对为初级细胞且不如来自细胞系的细胞强健的细胞有毒。

CD34+干细胞或祖细胞是特征为其自我更新和/或分化为淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)和髓系(例如单核细胞、红血球、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞)能力的异质性细胞组。其异质性源自CD34+干细胞群体中存在多个常反映特定群的多能性(不论定向的谱系)的子群的事实。例如，为CD38-的CD34+细胞是较为原始的未成熟的CD34+祖细胞(也称为长期造血祖细胞)，而那些为CD34+CD38+的细胞(短期造血祖细胞)是定向的谱系(参见Stella等人(1995)Hematologica 80:367-387)。当这一群体接着进一步以分化途径发展时，CD34标记物失去。CD34+干细胞在临床细胞疗法中具有巨大的潜力。然而，部分地归因於其异质性，可能难以在细胞上进行基因操作，诸如基因敲除、转基因插入等。具体来说，这些细胞通过常规的递送载体转导是不充分的，最原始的干细胞对修饰敏感，在引起的DNA DSB后，HDR受到限制，及在延长时间的标准培养条件中HSC维持不足。另外，其它受关注的细胞(仅举非限制性实例来说，心肌细胞、中型棘突神经元、初级肝细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞和肌细胞)转导以进行基因组编辑可能不如其它细胞成功。

因此，仍需要用于对CD34+细胞和其它受关注的毒性较小但更有效的细胞基因组工程改造的组合物和方法。

发明概要