[发明专利]一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法

说明书

本发明涉及一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法，其包括：(1)筛选获得一株高产雪腐镰刀烯醇的野生型亚洲镰刀菌，产雪腐镰刀烯醇量为来源菌株平均产量的18.34倍；(2)通过Double‑joint PCR方法构建野生型亚洲镰刀菌雪腐镰刀烯醇生物合成负调控基因FaFlbA的敲除载体，并利用PEG介导的原生质体转化方法获得野生型亚洲镰刀菌的原位替换突变体。本发明亚洲镰刀菌RR108菌株的FaFlbA基因缺失突变体中雪腐镰刀烯醇的产量显著提高，在大米培养基中约为野生型菌株的9.42倍。所述的野生菌株和原位替换突变体可以用于雪腐镰刀烯醇标准品制备，对于保障小麦的质量安全具有重要意义。

技术领域

本发明涉及种一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法，具体涉及通过自然筛选获得的高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株并以其作为基础菌株通过靶向基因敲除技术构建得到雪腐镰刀烯醇高产突变菌株突变体。

背景技术

小麦是全球种植面积最大、总产量最高、也是最为重要的粮食作物，超过1/3的世界人口以小麦制品为主食。2018年我国小麦播种面积达到1664万公顷，总产量约1.34亿吨，小麦是中国半数以上人口的主粮，小麦及其制品的质量安全直接关系到我国过半人口的食品安全。禾谷镰刀菌复合种(Fusarium graminearum species complex，FGSC)侵染小麦引起赤霉病，不仅会造成巨大的粮食减产，而且其侵染过程中会产生多种镰刀菌毒素，目前已经获知的镰刀菌毒素包括单端孢霉烯A族的T-2毒素和HT-2毒素、单端孢霉烯B族的雪腐镰刀烯醇(nivalenol，NIV)和脱氧雪腐镰刀烯醇(deoxynivalenol，DON)以及玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等。这些有毒的次生代谢产物具有细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性、生殖毒性和致癌、致畸及致突变作用，给食品安全和人畜健康造成严重威胁。

亚洲国家的优势菌群为亚洲镰刀菌(Fusarium asiaticum)，主要产3ADON(脱氧雪腐镰 刀烯醇的乙酰化化学型)和雪腐镰刀烯醇，我国是镰刀菌毒素受害最为严重的国家之一，我国政府部门高度重视镰刀菌毒素污染，国家标准制定了较欧美国家更为严苛的小麦及面粉中脱氧雪腐镰刀烯醇限量标准(1000μg/kg)，但目前尚未制定雪腐镰刀烯醇限量的相关法规。据研究表明雪腐镰刀烯醇相比于脱氧雪腐镰刀烯醇的毒性更强，急性中毒症状表现为镇静、眼睑闭合、步态蹒跚、腹泻和肺、消化道充血、厌食等；慢性中毒症状表现为动物的体重降低，各脏器质量减轻伴随肿瘤发生。细胞毒性试验结果也显示雪腐镰刀烯醇比DON的更易致突变，存在致癌风险，国际癌症研究机构将其归类为3类致癌物。鉴于上述，从长远的观点而言，应当对雪腐镰刀烯醇发生的风险评估和污染防治应当给予高度重视。

长期监测雪腐镰刀烯醇的发生风险需要建立精准的仪器检测方法，获得高纯雪腐镰刀烯醇标准品则成为进行有效监测的先决条件。目前雪腐镰刀烯醇标准品主要依赖进口，且价格非常昂贵(1mg的雪腐镰刀烯醇标品价格约折合人民币1.8万元)。此外，近年来为研发粮食污染后处理方案，真菌毒素的生物脱毒成为研究热点。黄曲霉毒素、伏马毒素和玉米赤霉烯酮等的毒素降解微生物逐步用于污染粮食的脱毒处理，而对于雪腐镰刀烯醇而言昂贵的标准品也完全限制了其降解微生物的筛选工作的进展。因此，如能在雪腐镰刀烯醇标准品的制备上有所突破将为雪腐镰刀烯醇的暴露评估与控制提供测量校准和质量控制，对于保障小麦产品的质量安全有着重要的意义。

中国发明专利201610041250.9公开了一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物及方法，所述诱导物为2mM～4mM的腺苷-3′，5′-环单磷酸、2mM～4mM的腺苷-3′，5′-环单磷酸钠盐或8～12mg/ml的咖啡因。该发明采用cAMP、cAMP钠盐或咖啡因诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成，使得其产毒量及毒素合成周期缩短，但由于其基因未发生变化，其产量提高有限。