[发明专利]烟草CyP71及在调控植物表皮毛发育方面的应用

权利要求书

1.一种调控植物表皮毛发育的基因，其特征在于：该基因为烟草CyP71，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种调控植物表皮毛发育的基因，其特征在于：所述的CyP71，其克隆正向引物为5'-ATGCAACTGAGATTTGAAG-3'，反向引物为5'-TCACTTTTGAGGAGGTTG-3'。

3.如权利要求1或2所述的一种调控植物表皮毛发育的基因的植物表达载体的构建及遗传转化方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）以测序正确的烟草CyP71基因T克隆重组质粒为模板，酶切引物扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化；（2）对酶切引物扩增产物和pSH737进行双酶切，37℃恒温水浴酶切反应1.5h，酶切完成对产物进行电泳检测并切胶回收目的片段；（3）pSH737表达载体和酶切引物扩增产物的双酶切产物在T4连接酶的作用下，于恒温水浴16℃连接10h，连接为重组表达载体；（4）将连接产物转化到农杆菌LBA4404，并在其中扩增，选择Kan LB进行抗性筛选，然后进行菌落PCR验证其为阳性重组菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证，并测序，成功得到pSH737-CyP71。

4.根据权利要求3所述的一种调控植物表皮毛发育的基因的植物表达载体的构建及遗传转化方法，其特征在于：所述的酶切引物为：上游引物序列为5'-GCTCTAGAATGCAACTGAGATTTGAAG -3'，下游引物序列为5'-TCCCCCGGGTTATCACTTTTGAGGAGGTTG -3'。

5.根据权利要求3所述的一种调控植物表皮毛发育的基因的植物表达载体的构建及遗传转化方法，其特征在于：所述的双酶切采用XbaI和SmaI进行。

6.根据权利要求3所述的一种调控植物表皮毛发育的基因的植物表达载体的构建及遗传转化方法，其特征在于：所述的烟草CyP71基因T克隆重组质粒的合成方法：分别利用CyP71克隆引物通过RT-PCR的方法从烟草中扩增基因，将扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到克隆中间载体:pGEM-T上，在T4 DNA连接酶的作用下，将PCR产物与T载体充分混匀，于16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，随后进行菌落PCR和质粒PCR筛选阳性克隆，并测序即可。

7.根据权利要求6所述的一种调控植物表皮毛发育的基因的植物表达载体的构建及遗传转化方法，其特征在于：所述的RT-PCR反应程序为: 50℃ 30min，94℃ 2min，94℃ 30S,55-65℃ 30S，72℃ 1min/kb，30个循环。