[发明专利]一种于体外长期维持肝细胞功能的培养体系及成熟肝细胞的长期体外培养方法

说明书

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种于体外长期维持肝细胞功能的培养体系及采用该培养体系进行成熟肝细胞长期体外培养的方法，该培养体系包括如下组分：液体基础培养基、0‑5×B27添加剂、0‑5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、0‑100mM尼克酰胺、0‑1mM地塞米松、0‑500μg/mL维生素C、0‑10μM Latunculin B、0‑50μM Blebbistatin、0‑50μM Dasatinib、0‑500μM XAV939和0‑10000μM的LY294002。成熟肝细胞长期体外培养的步骤如下：A、预先包被培养支持物并于4℃保存过夜；B、采用含有1％基质胶的培养体系将刚分离肝细胞种植于该培养支持物上，4～6小时后采用含1％基质胶的培养体系换液去除未贴壁细胞，之后每天换液直至第三天，三天后更换为不含基质胶的培养体系换液直至三周。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种能够在体外长期维持肝细胞功能的培养体系，以及采用该培养体系体外长期培养成熟肝细胞的方法。

背景技术

肝脏是维持体内稳态的核心器官，发挥着诸如代谢、糖原贮存、药物解毒、多种血清蛋白合成以及胆汁分泌等广泛的作用。目前全世界有超过13亿人受到肝脏疾病的困扰，仅在我国每年因肝病死亡的患者超过30万。对于终末阶段肝病，唯一可能的治疗手段便是肝移植，但是每年可供移植肝脏仅能满足5％肝病患者的需求，可供移植肝脏的匮乏严重限制了该治疗手段的临床应用。

虽然近期由多能干细胞分化或者通过谱系重编程来得到的肝细胞或肝祖细胞的研究取得了显著的进步，但在体外得到与体内肝细胞功能相近的肝细胞依旧十分困难。即便是刚分离得到的原代肝细胞在体外培养中短时间内就会丧失肝细胞的关键功能。因此，无法于体外维持成熟肝细胞的功能一直是阻碍细胞移植治疗应用以及得到有效的药物筛选平台的瓶颈。

目前，诸多希望能够在体外维持肝细胞功能的研究都将重点集中在了肝细胞培养中的培养条件配置、培养基以及微环境上。但是，导致体外培养的肝细胞去分化的驱动因素仍未被发现，而明确肝细胞去分化的机制对于设计出在体外有效维持肝细胞表型和功能的方法有非常重要的意义。同样，明确这一机制也是通过干细胞分化及谱系重编程得到有功能肝细胞的重要前提。由于这一机制的尚不明确，目前尚无有效的、化学成分明确的培养体系能够在体外长期稳定的维持成熟肝细胞的分子表型和功能。

因此，本领域尚缺乏有效手段于体外维持肝细胞的分子表型和各项功能，尤其是无法在化学成分明确的培养条件下实现体外肝细胞功能的长期维持。

发明内容

本发明是为解决上述问题而进行的，针对现有技术中成熟肝细胞体外培养过程中难以维持肝细胞的分子表型和各项功能的缺陷，提供了一种于体外长期维持肝细胞功能的培养体系及成熟肝细胞的长期体外培养方法。

本发明的第一方面，提供了一种于体外长期维持肝细胞功能的培养体系，该体系包括一种化学成分明确的成熟肝细胞培养基，用于小鼠肝细胞的体外培养。使用该培养体系，小鼠肝细胞于体外可以长期培养并维持成熟肝细胞的分子表型及功能长达3周以上，且具备移植到体内后存活、增殖、整合以及恢复肝脏功能的能力。该培养体系包括如下组分：

液体基础培养基、0-5×B27添加剂、0-5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、0-100mM尼克酰胺、0-1mM地塞米松、0-500μg/mL维生素C、0-10μM Latunculin B、0-50μMBlebbistatin、0-50μM Dasatinib、0-500μM XAV939和0-10000μM的LY294002。

在该培养基中，液体基础培养基、B27添加剂、N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、尼克酰胺、地塞米松、维生素C构成基础培养基(即BM)，Latunculin B、Blebbistatin、Dasatinib、XAV939和LY294002作为肝细胞功能维持因子加入BM培养基中，用于维持成熟肝细胞的分子表型及功能。

优选的，液体基础培养基为DMEM/F12液体基础培养基。