[发明专利]一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法

说明书

本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法，所述培养基为固液双层培养基，所述培养基上层为NLN13液体培养基，所述培养基下层为B5培养基改良的固体培养基。所述培养方法采用两步法培养油菜小孢子，第一步采用NLNM液体培养基培养，第二步采用固液双层培养基培养。本发明显著提高了子叶胚的得出率，而且保证了子叶胚的质量，进而提高小孢子培养获得双单倍体植株的效率。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法。

背景技术

自1982年德国的Lichter首次报道从甘蓝型油菜中成功分离得到游离的小孢子，利用小孢子培养诱导单倍体继而加倍获得双单倍体(DHs)后。小孢子培养创建的双单倍体目前已经应用到油菜重要农艺性状的遗传图谱构建、重要性状QTLs定位以及双单倍体育种实践中。

虽然在甘蓝型油菜中已经建立了适用性强的小孢子培养技术体系，但是针对不同基因型差异的材料，在小孢子培养过程中产生高质量子叶胚的能力存在巨大差别。以前研究结果显示小孢子培养后得到的胚大多数是球形胚、心型胚或者类似于胚的结构(embryo-like structures，ELS)，只有少数是子叶胚。子叶胚在成苗培养基上能够快速生长获得生长势强、根系发达的植株，而其它类型的胚以及类似于胚的结构转移到再生培养基上难以一次成苗，甚至褐化死亡，这样极大程度上降低了小孢子培养获得双单倍体植株的效率。

发明内容

有鉴于此，本发明通过改进了培养基和培养方法，显著提高了油菜小孢子培养中子叶胚得出率且保证了子叶胚的质量。

为了达到上述目的，本发明一方面提供了一种用于油菜小孢子培养的固液双层培养基，所述培养基上层为NLN13液体培养基，所述培养基下层为B5培养基改良的固体培养基；

所述NLN13液体培养基为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5gKH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24gH₃BO₃，3.474g MnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005g CuSO₄.5H₂O，0.005g CoCl₂.6H₂O，1g烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，130g蔗糖，0.1g肌醇，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽；

所述固体培养基为：每1000mL含有B5基本培养基，0.1～0.75g活性炭，0.1～0.75mg 6-BA，3g蔗糖，0.55g Phytagel；

优选的，所述固体培养基中活性炭的含量为0.1g/L。

优选的，所述固体培养基中6-BA的含量为0.25mg/L。

本发明第二方面提供了一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，该方法采用上述的固液双层培养基，具体包括以下步骤：

S1、小孢子的收集和分离：摘取主花序和分支的花蕾，经低温预处理、灭菌、清洗后，加入小孢子抽提缓冲液提取小孢子，过滤，离心，收集小孢子细胞，用NLNM液体培养基垂悬；