[发明专利]一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法

权利要求书

1.一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、小孢子的收集和分离：摘取主花序和分支的花蕾，经低温预处理、灭菌、清洗后，加入小孢子抽提缓冲液提取小孢子，过滤，离心，收集小孢子细胞，用NLNM液体培养基垂悬；

S2、小孢子热激预处理：调整步骤S1所述NLNM液体培养基中的小孢子细胞数目后，放入培养皿中，封口，置于31±1℃培养箱中暗培养48小时；

S3、小孢子细胞培养：将步骤S2处理后的小孢子细胞离心重悬后，放入培养皿中封口暗培养一段时间，然后将小孢子悬浮液转移至固液双层培养基中暗培养，每1~2周补充NLN13液体培养基，待胚大小肉眼可见，将含有固液双层培养基的培养皿置于摇床上于19~25℃下暗培养3~4周；

所述固液双层培养基的上层为NLN13液体培养基，所述固液双层培养基的下层为B5培养基改良的固体培养基；

所述NLN13液体培养基为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5g KH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24g H₃BO₃，3.474g MnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005g CuSO₄.5H₂O，0.005gCoCl₂.6H₂O，1g 烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，130 g蔗糖， 0.1 g肌醇 ，0.8 g谷胺酰胺，0.1 g丝氨酸，0.03 g谷胱甘肽；

所述固体培养基为：每1000mL包含0.32g B5基本培养基粉末，0.1~0.75 g活性炭，0.1~0. 5 mg 6-BA，3g蔗糖，0.55g Phytagel；

所述NLNM液体培养基为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5g KH₂PO₄，10gCa(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24g H₃BO₃，3.474gMnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005g CuSO₄.5H₂O，0.005gCoCl₂.6H₂O，1g 烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，65g蔗糖， 0.1g肌醇 ，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽，4g甘露醇。

2.根据权利要求1所述的提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，其特征在于，所述固体培养基中活性炭的含量为0.1g/L。

3.根据权利要求1所述的提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，其特征在于，所述固体培养基中6-BA的含量为0.25 mg/L。

4.根据权利要求1所述的提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，其特征在于，所述含有固液双层培养基的培养皿在摇床上的培养温度为23℃。