[发明专利]一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法

说明书

本发明提供了一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，包括将鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基分别按不同体积比混合，置于第一多孔板中；将鼠尾I型胶原、DMEM基础培养液及CM‑LV‑LOXL2‑OE按1：10：5体积比混合，置于第二多孔板中；将第一多孔板和第二多孔板放入37℃温箱静置；将成胶后的基底置于4℃冰箱中10～14h，形成不同基底硬度体外细胞培养平台。本发明能够较好地模拟体内1KPa低硬度脏器组织硬度变化，为寻找实体肿瘤发生肺转移的共性分子特征，探讨转移靶器官重塑改造成“适宜土壤”的相关病理机制提供一种新型体外研究平台。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种细胞培养技术，具体涉及一种模拟体内肺组织硬度的体外细胞培养平台的制备方法及其在研究肿瘤肺转移过程中预转移龛形成机制中的应用。

背景技术

大量临床数据显示，许多实体肿瘤包括肝癌、食管癌、乳腺癌等均易发生肺转移。寻找实体肿瘤发生肺转移的共性分子特征，以及探讨转移靶器官在肿瘤定植转移前重塑改造成“适宜土壤”的相关病理机制逐渐成为当前肿瘤转移研究的新增长点，故能否建立起可反映肺组织硬度特征的理想体外研究平台无疑对上述研究方向的推动将是显著的。

在对肿瘤转移认识的历史进程中，曾出现过三个经典的肿瘤转移学说，包括Paget的“种子土壤学说”，Ewing的“解剖机制学说”，以及Bross和Blumenson的“转移瀑布学说”。上述三个学说分别从转移非随机性，转移途径，转移的多因素、多阶段三个不同角度对实体肿瘤转移进行解释，极大地促进人类对转移机制的认识及转移研究的深入。但鉴于经典理论缺乏将原发瘤和靶器官转移灶联系起来的“桥梁”，始终无法回答原发瘤如何选择转移靶器官，影响转移灶形成。2005年预转移龛学说(Premetastatic niche)的提出，将三种经典转移学说进行了较好的汇集与融合，使原发瘤与转移靶器官有机地联系了起来，显示出较强的理论创新与生命力，逐渐成为当前肿瘤转移研究的新方向。该学说认为，原发瘤细胞分泌的部分可溶性因子TDSF或外泌体囊泡(exosome)作为“信使”，经体循环到达转移靶器官，在靶器官募集骨髓来源的骨髓衍生细胞BMDCs，被募集的BMDCs细胞与TDSF、组织固有间质细胞在靶器官组织相互作用，使靶器官组织“土壤环境”重塑改造，形成有利于血液循环肿瘤细胞粘附与定植的预转移龛，加速转移在靶器官的最终实现。目前，“预转移龛”已在一些肿瘤动物模型如乳腺癌、结肠癌，胰腺癌，黑色素瘤等中获得证实。我们课题组前期也发现基质硬度可激活integrinβ1/α5/JNK/c-JUN信号通路上调肝癌细胞LOXL2表达分泌，加速肝癌肺预转移龛形成，为从肺预转移龛形成阐明肝癌转移机制提供了新视角(J Exp ClinCancer Res.2018；37(1):99.IF 6.217)。

研究已经证实，肿瘤微环境的细胞组分(成纤维细胞、肝星状细胞、血管内皮细胞、浸润的免疫细胞、巨噬细胞、MSCs，DC等)与非细胞组分(生长因子、趋化因子、基质蛋白、exosome等)均参与肿瘤侵袭转移的调控。除此之外，肿瘤周边的物化因素包括缺氧、温度、硬度、酸碱等参与肿瘤侵袭转移的研究近年也逐渐增多。胞外基质硬度是细胞微环境的一个重要物理参数，其变化可改变锚着细胞所处的机械力学环境，使细胞形态特征、粘着斑装配、细胞骨架状态有很大变化，这些变化可显著影响参与体内多种病理生理过程如组织发育、纤维化、肿瘤转移等。作为实体肿瘤的显著物理特征，基质硬度与肿瘤发生发展密切关联已获得临床大量数据的支撑，但其如何调控肿瘤发生进展的相关分子机制研究目前却依然处于起步阶段，缺乏理想体外硬度相关实验平台是制约硬度相关研究开展的最主要障碍。