[发明专利]一种肝脏干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种肝脏干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：A、向离体肝脏注入3～5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；B、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20～30min；C、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为200～300mL/min，持续2～3min；D、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化45～60min；E、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；F、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24～36h。本发明能够改进现有技术的不足，提高了肝脏干细胞分离培养的成功率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种肝脏干细胞的分离培养方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的原始未分化细胞，处于未定向分化状态并具有增殖能力。在特定条件下，干细胞可分化成不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。肝脏干细胞可以转化为新的肝脏细胞，对于严重的肝脏疾病有着非常好的治疗前景。由于肝脏干细胞含量极少，现有技术中对于肝脏细胞的分离培养成功率较低，在实验室中通常需要多次分离培养才能获得足够的肝脏干细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肝脏干细胞的分离培养方法，能够解决现有技术的不足，提高了肝脏干细胞分离培养的成功率。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种肝脏干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

A、向离体肝脏注入3～5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；

B、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20～30min；

C、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为200～300mL/min，持续2～3min；

D、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化45～60min；

E、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；

F、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24～36h。

作为优选，步骤A中，保存液采用UW液。

作为优选，步骤B中，缓冲液包括以下组分，

0.35wt%的KCl、0.1wt%的CaCl₂、0.55wt%的NaHCO3、0.15wt%的Na₂HPO₄·2H₂O，余量为水。

作为优选，步骤C中，灌流液包括以下组分，

0.03wt%的KCl、0.01wt%的庆大霉素、0.02wt%的青霉素、0.05wt%的HEPES、0.75wt%的NaCl，余量为水。

作为优选，步骤D中，胶原酶溶液包括以下组分，

0.3wt%的Ⅱ型胶原酶、0.1wt%的KH₂PO₄、0.05wt%的MgSO₄·7H₂O、1.5wt%的葡萄糖，余量为水；

配置完成后，通过添加柠檬酸使胶原酶溶液的pH值达到6.5～6.8。

作为优选，步骤E中，清洗液包括以下组分，

0.55wt%的KH₂PO₄、0.15wt%的MgCl₂、2.5wt%的双抗、0.05wt%的HEPES，余量为水。