[发明专利]基因缺失型中间气单胞菌

说明书

本发明公开了一种基因缺失型中间气单胞菌，其相较于中间气单胞菌WS基因组中缺少katE基因。相较于野生菌株WS，本发明所提供的基因缺失型中间气单胞菌，死亡提前发生，并且能够保持完整的细胞形态，适合作为模型生物研究黑色素形成机制以及作为生物反应器生产黑色素，其作为生物反应器应用于工业化生产中前景良好，无需后续处理，可节约成本，简化操作。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种经过遗传改造的基因缺失型中间气单胞菌。

背景技术

中间气单胞菌WS(Aeromonas media WS)是从东湖分离得到的一株高产黑色素菌株，具有色素合成能力强和合成时间短的特性。黑色素通常是由酚类或吲哚类物聚合形成，它是一类疏水性生物大分子。它广泛存在于动物、植物和微生物中。已有研究表明，黑色素能极大地提高生物生存竞争能力，因此，黑色素的普遍性存在被认为是进化过程中生命与环境长期相互适应的结果。按合成途径的不同，细菌合成的黑色素通常是真黑色素和脓黑色素。中间气单胞菌WS主要通过尿黑酸途径合成脓黑色素，通过研究中间气单胞菌WS的黑色素合成机制有助于进一步揭示黑色素形成分子机制及生物学功能。

由于缺少比较合适的模型生物，目前对于黑色素的合成和生物学功能研究仍处于初级阶段。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中缺少研究黑色素形成分子机制以及生物学功能的生物模型这一问题，提供一种合适的模型生物。

第一方面，本发明提供了一种基因缺失型中间气单胞菌，相较于中间气单胞菌WS，其基因组中缺少katE基因。

katE基因编码的是过氧化氢酶CAT，过氧化氢酶是一类能够高效清除过氧化氢的末端氧化酶，广泛存在于动物、植物和微生物体内，它主要是以过氧化氢为底物，通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气。而过氧化氢是一类活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，在生物体内存在适量过氧化氢可以作为第二信使参与细胞的信号转导通路，引起免疫细胞的激活、细胞增生等；相反，当过氧化氢在细胞中过量累积时，会造成细胞毒性，如蛋白羰基化、DNA损伤等，因此，CAT能够防止由于ROS水平过高对细胞产生的毒害，并与超氧化物歧化酶、过氧化物酶共同组成抗氧化酶系，从而应答细胞的氧化胁迫。

另外，已有文献报道发现，在一些物种中黑色素的合成对体内ROS水平的影响，但具体涉及到的催化反应研究仍是没有涉及。虽已有报道在大肠杆菌中，OxyR作为一个全局性的转录调控因子，介导和调控oxyR、kat和ahp基因，并通过其相互协同作用，识别调控过氧化氢，影响菌株整体的生长与繁殖。另有研究者发现缺失OxyR会导致大肠杆菌在平板培养时有生长缺陷。

本发明研究发现，缺少katE基因的中间气单胞菌WS，黑色素产率明显降低，且发生提前死亡(培养24h内就会发生提前死亡的现象)，而且死亡后细菌仍然能够保持完整的细胞形态。缺少katE基因的中间气单胞菌非常适合作为模型生物，有助于深入研究黑色素的合成和生物学功能。另外，由于该菌的特性，还可以作为生产各类酶制剂的生物反应器，为工业化生产提供新思路。

进一步地，上述基因缺失型中间气单胞菌，是由中间气单胞菌WS经过katE基因敲除制备而成。人工遗传改造操作更加简便可控。

进一步地，上述基因缺失型中间气单胞菌，具体制备方法如下：

1)以中间气单胞菌WS的基因组为模板，设计引物扩增获得katE基因的上游同源臂和下游同源臂，两同源臂均带酶切位点；

2)将上游同源臂和下游同源臂一起连接至携带氯霉素抗性基因的自杀性载体pDM4上，转化到大肠杆菌中，在添加氯霉素的培养基上进行培养，获得敲除载体；

3)以中间气单胞菌WS作为受体菌，步骤2)获得的含敲除载体的大肠杆菌为供体菌，利用二亲本接合法将二者混合，在不添加抗生素的培养基中培养，使敲除载体进入受体菌；