[发明专利]一种鉴定关键酶基因的植物物种特异性序列片段的方法

说明书

本发明提供了一种鉴定关键酶基因在特定植物物种中的特异性序列片段的方法，该方法运用分子系统学和生物信息学的分析方法，重建关键酶基因在不同植物类群中的系统发生关系，比较分析不同类群间的序列、结构和分化，鉴定了该酶在特定植物物种中的特异性序列片段及其关键变异位点。本发明还提供了获得的特异性序列片段在植物或特定药材基源鉴定、品种改良或选育中的应用。

技术领域

本发明属于生物信息学分析技术领域。具体而言，本发明涉及利用生物信息学和分子系统学的分析方法，对来源于不同物种的关键酶基因家族的特异性序列片段与功能分化位点的研究方法，特别涉及对关键酶基因在特定植物物种中的特异性序列片段与功能分化位点的捕捉与挖掘方法及其应用。

背景技术

生物信息学是一种以核酸、蛋白质等生物大分子数据库为主要对象的研究方法，其以数学、信息学、计算机科学为主要手段，以计算机硬件、软件和网络为主要工具，对大量原始数据进行存储、管理、注释、加工，使之成为具有明确生物意义的生物信息。

生物信息学在植物或药材的抗性基因研究、鉴定和应用等方面已经发挥了重要的作用。随着越来越多的植物全基因组得到克隆，还可以采用生物信息学手段，对特定基因，例如某种植物有效成分的合成基因或其合成通路中的重要基因，在模式植物基因组与其它植物基因组之间进行同源性分析，建立该基因在不同植物类群中的系统发生关系，比较序列、结构和分化，从而捕捉特定植物物种中的特异性序列片段或其中的功能分化位点，从而为植物或药材的鉴别、品质改良、育种等提供技术基础。

以菘蓝(Isatis indigotica Fort.)为例，菘蓝为十字花科草本双子叶植物，其干燥根即板蓝根(Radix isatidis)，功能和主治为清热解毒，凉血利咽。近年来，国内外学者对菘蓝化学成分进行了研究，分离出近200种化合物，但是大部分化合物在植物体内的含量均非常低。例如，菘蓝所含的木脂素(Lignan)，这是一类由2分子苯丙素衍生物氧化聚合而成的植物次级代谢产物，大量的药理学研究表明其具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和保肝等多种药理活性和重要的应用价值；但是，木脂素在板蓝根中的含量仅为每克几十微克计。目前木脂素主要通过植物提取制备，操作繁琐、耗时长、成本高；而且这种方式还受限于菘蓝的生长时间和种植地域，已经造成板蓝根资源的不合理利用和浪费。如何提升有效成分例如木脂素的含量，已成为菘蓝育种的主要问题。

常规育种实践中，对于富含有效成分的药材居群的选择是十分困难的：一方面选育周期可能很长，需要经历杂交和回交复杂的选择程序；另一方面有效成分的形成受到很多因素的综合影响，例如温度、湿度和土壤等。

已知挖掘有效成分的合成基因可以加快植物品种选育进程。木脂素合成通路中最重要的酶是落叶松脂醇还原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductase，PLR)，这是一种依赖NAD(P)H的氧化还原酶，最早从连翘(Forsythia intermedia)中被鉴定并克隆。大量研究表明，PLR参与并直接影响了木脂素的生物合成。由此可知，挖掘植物中的PLR基因对菘蓝富含木脂素类化合物品种的育种将具有重要的作用。

目前，挖掘基因例如抗病基因的常用方法有图位克隆、转座子标签等。但是，由于大部分药材的基础研究不够深入，利用这些方法不仅时间长而且很难准确地克隆基因。

因此，对于来源于不同物种的关键酶基因家族，挖掘该基因在特定植物物种中的特异性序列片段与功能分化位点，本领域仍然需要提供新型研究方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下研究思路：可利用已有的植物基因组数据，从中搜寻、鉴别和筛选关键酶基因的所有成员，然后充分运用分子系统学和生物信息学的分析方法，重建该酶基因在不同植物类群中的系统发生关系，比较分析不同类群间的序列、结构和分化，快速“捕捉”基因的特异功能分化位点。即，以已测序植物全基因组序列为前提，结合比较基因组学、生物信息学和候选基因策略等知识，快速挖掘关键酶基因的特异序列片段和功能位点。