[发明专利]一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法

说明书

本发明公开了一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，首先提取植物组织中总RNA；通过反转录PCR合成PCR反应模板；构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。利用本发明构建的重组表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆根系的根瘤数目。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种培育具有高结瘤能力的植物的方法。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，其通过根瘤可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供了必需的氮素营养。由根瘤介导的共生固氮过程不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境化学污染。目前，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一，而在分子层面了解大豆的结瘤和根瘤发生发育的分子机制是更加合理利用大豆高结瘤固氮效率这一特点的重要基础。

植物激素参与豆科根瘤的形成和发育过程，这其中细胞分裂素(Cytokinin)在调节根瘤发育中起关键作用(Ferguson and Mathesius，2014)。在豆科植物中，可以通过外源施用细胞分裂素诱导根瘤状的结构的发生(Mathesius et al.,2000；Heckmann et al.,2011)。在蒺藜苜蓿中过表达LOG基因(细胞分裂素核苷5'-单磷酸磷酸水解酶)使得根瘤的数目减少(Mortier et al.,2014)，异戊烯基转移酶(IPTs)是细胞分裂素生物合成的关键组分，在百脉根中叶片中由根瘤菌侵染诱导的LjIPT3可以促进细胞分裂素的合成并向地下运输来实现对二次结瘤的抑制(Sasaki et al.,2014)；除此之外，由根瘤菌侵染诱导的细胞分裂素氧化酶/脱氢酶基因(CKX)在根瘤原基和发育的根瘤中表达，蒺藜苜蓿中的ckx3突变体中细胞分裂素含量显着增加并抑制根瘤的发生，表明适量的细胞分裂素对豆科植物的结瘤特别重要(Dugald et al.,2016)。

百脉根细胞分裂素受体的功能获得型突变能够产生自发结瘤(Gonzalez-Rizzoet al.,2006)，而苜蓿和百脉根中的细胞分裂素受体突变体cre1和lhk1丧失了形成根瘤原基的能力。响应调节因子(RR)是细胞分裂素信号传导的下游关键组分，这其中A响应调节因子是细胞分裂素信号通路中的负调节因子，包括ARR3-ARR9和ARR15-ARR17，它们只有10个受体结构域和短C末端；而B型反应调节因子是细胞分裂素信号通路中的正调节因子，包括ARR1，ARR2，ARR10-ARR14，ARR18-ARR21，其具有11个信号接受结构域、C末端DNA结合结构域和转录激活结构域，它们可以直接调节下游靶基因并激活A型反应调节因子的表达(Jennifer et al.,2008)。

而关于RR在调控大豆结瘤中的作用，目前尚未见到。有关B型的响应因子RR11在大豆根系结瘤和共生固氮中是否有调控作用还没有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，通过在植物中下调表达序列表中SEQ ID NO：1所示的基因片段或其同源基因，以增加受体植物根系的结瘤数目。

作为本发明的一种优选技术方案，构建敲除载体并转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。

作为本发明的一种优选技术方案，操作步骤包括：A、首先提取植物组织中总RNA；B、通过反转录PCR合成PCR反应模板；C、构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；D、通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。