[发明专利]使用柑橘衰退病毒载体进行外源基因表达

说明书

本发明揭示了基于对柑橘衰退病毒的修改、为有益目的用于转染柑橘树的病毒载体。本发明揭示了包括含有一个或多个编码异源性多肽的基因盒的病毒载体。所述基因盒位于病毒基因组上的理想位点，使得增加表达量的同时保存病毒的功能性。本发明同时揭示了用病毒载体转染植物的方法以及被病毒转染的植物的实施例。

相关申请的交叉参考

本申请根据美国法典第35篇第119条(35 USC 119)要求2011年9月21日提交的美国专利申请第61/537,154号的优先权，并通过引用将其纳入本文中。

背景技术

病毒载体的早期开发目的是廉价生产该领域可等比扩大的专门蛋白。最初使用的是一种植物病毒载体，即一种双链DNA病毒花椰菜花叶病毒(Brisson et al.，1984；Gronenborn et al.，1981)。然而，这种病毒稳定性过低，因而无法使用(Fütterer et al.，1990)。反向遗传学系统的发展使得RNA病毒也能够被利用，载体的开发有了更多选择(Ahlquist et al.，1984)。

病毒载体是基础研究的重要元素，有巨大的商业应用潜力。但外源插入物质稳定性不高是病毒载体用于应用领域蛋白表达商业化的一个主要缺点。

发明内容

本申请是基于多项探索利用CTV载体表达806到3480个核苷酸外源基因的局限性研究。在一个实施例中，基因盒被引入CTV基因组中以替换p13基因。在其他实施例中，基因被插入在不同位点(例如，p13-p20、p20-p23和p23-3’NTR(非转录区))。在另一个实施例中，检测了p23融合与蛋白酶加工的作用。在可替代的实施例中，基因被插入在IRES序列后来创建双顺反子信息。

27个表达载体被创造并在本生烟原生质体和植物中进行检测。值得注意的是，这里介绍的多数新开发出的载体结构在植物中复制、系统地播散，产生外源基因。检测到的表达量最大的载体包括p13-p20或p23-3’NTR的“添加基因”结构。类似地，插入基因取代p13基因的载体有效地表达了不同的报告基因。然而，报告基因的最优表达取决于插入基因的大小和部位。表达最优的小基因为靠近3’端处的基因，而表达最优的大基因来自多个内部位点。

在本生烟和柑橘上都实现了相同载体上两种基因的同时有效表达。本文介绍的新CTV载体的基因组有独特的弹性结构，能够通过多种方法容纳并表达外源基因。

对一种有效的载体进行基因工程处理需要平衡不同因素。载体需要精心设计，让植物中的复制和系统转移最小化，同时外源蛋白的表达最大化(Shivprasad et al.，1999)。最后一个因素是载体的稳定性。简言之，载体的有用性直接与其稳定性相关。稳定性是载体减少重组、提高竞争力的结果，所产生的重组体丢失部分或全部插入序列。

附图说明