[发明专利]一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法

说明书

转录水平的基因表达调控需要严谨调控的启动子，同时要求启动子具有可诱导、可放大。现有基因表达调控系统诱导剂价格昂贵且需要特定培养基成分很难用于大规模发酵。将代谢途径基因中的氨基酸密码子替换成其稀有形式，可通过是否补加相应氨基酸实现该基因表达调控，诱导物相对廉价易得对细胞无毒害作用，可实现基因翻译水平更加精准的调控，减少泄露表达，且不会干扰到其他基因的表达和影响菌体的正常生长。

技术领域

本发明涉及一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

转录水平的基因表达调控需要严谨调控的启动子，同时要求启动子具有可诱导、可放大。现有基因表达调控系统诱导剂价格昂贵且需要特定培养基成分很难用于大规模发酵。

将代谢途径基因中的氨基酸密码子替换成其稀有形式，氨基酸缺乏条件下基因不表达，外源补加对应氨基酸可实现该基因表达。利用稀有密码子进行基因表达调控拥有诸多优势。首先，实现基因翻译水平更加精准的调控，减少泄露表达。其次，稀有密码子对基因表达的调控只作用于含有此密码子的基因中，不会干扰到其他基因的表达和影响菌体的正常生长；而诱导物是氨基酸相对廉价易得，对细胞无毒害作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法，利用密码子偏好性和tRNA氨酰化水平的差异，在翻译水平上，简单有效地通过补加氨基酸实现基因表达调控，为代谢工程的基因表达调控提供新的方法。

按照本发明提供的技术方案，一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法，采用以下方法步骤：

1.需要确定所用菌株和所需调控的基因，确定所用菌株的密码子偏好性。

2.根据氨基酸密码子偏好性和调控基因序列，确定选用的氨基酸和其稀有密码子，将所需调控基因中的相应氨基酸的密码子替换为对应的稀有密码子，使用PCR方法重新人工合成此序列。

3.将步骤2中人工合成的基因序列与质粒载体连接，将连接产物化转至大肠杆菌中，经过PCR验证，挑选正确的单菌落，保存菌液，提取质粒。

4.将步骤3中得到的含正确质粒的菌株涂于平板上培养。

5.挑取单菌落接入培养基中，加入相应的氨基酸，检测调控基因表达量和菌体浓度。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、利用稀有密码子在翻译水平调控GFP表达的方法

以大肠杆菌DH5α(购于北京博迈德基因技术有限公司)为例，大肠杆菌DH5α翻译使用的亮氨酸密码子共有UUG，UUA，CUC，CUG，CUU和CUA六种，其中密码子CUA的使用频率最低(记载大肠杆菌密码子偏好性的非专利文献为Dong H,Nilsson L,Kurland C G.,1996，Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at differentgrowth rates.Journal of molecular biology,260(5):649-663.)。将绿色荧光蛋白GFP中的亮氨酸对应的密码子全部替换为稀有密码子CUA，采用基因全合成的方法得到序列1所示的绿色荧光蛋白基因。