[发明专利]一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法

说明书

本发明公开了一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，包括先获取无菌苗，后切取带柄子叶作为外植体，接种到诱导培养基上诱导获得不定芽、再依次切分转移至伸长培养基和生根培养基，其中MS诱导培养基为MS+6‑BA 5.0mg/L+IAA 0.5mg/L+AgNO₃ 3.0mg/L；伸长培养基为MS+6‑BA 2.5mg/L+IAA 0.8mg/L+GA₃ 3.0mg/L+AgNO₃ 3.0mg/L；生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mg/L，待生根苗株高至8‑10cm，去瓶盖置于室温自然光照下炼苗移栽，采用柔毛辣椒带柄子叶作为外植体，应用开发的诱导培养基、伸长培养基和生根培养基，首次获得了具有较高诱芽率和生根率的离体再生苗，本发明方法构建的离体再生体系，为柔毛辣椒的基因功能验证以及分子育种奠定了研究基础。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法。

背景技术

组织培养是农业生物技术的重要组成部分，在蔬菜作物离体再生过程中发挥重要作用。辣椒为茄科辣椒属植物，是我国主要蔬菜之一，辣椒属(Capsicum L.)共有5个栽培种：一年生辣椒(Capsicum annuum)、中国辣椒(Capsicum chinense)、灌木状辣椒(Capsicum frutescens)、下垂辣椒(Capsicum baccatum)和柔毛辣椒(Capsicumpubescens)。柔毛辣椒种子为黑色或近黑色，果肉较厚；花为紫色或浅紫色，基部有白色环，花上通常有一个黄色蜜腺的凸起斑点，植株有毛。柔毛辣椒(Capsicum pubescens)与其它辣椒栽培种相互间授粉产生不了种子，存在生殖隔离，因此柔毛辣椒的离体培养意义重大，目前还没有一种适用柔毛辣椒(Capsicum pubescens)诱导离体再生方法的文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，解决采用现有培养基离体培养柔毛辣椒仅产生少量的愈伤组织且不定芽的分化率很低且根系再生能力弱的问题，首次实现柔毛辣椒的离体再生，包括以下步骤：

(1)无菌苗的获取：取柔毛辣椒的种子置于超纯水中，低温浸泡后进行灭菌处理，再接种到MS培养基上培养得到辣椒无菌苗；

(2)不定芽的诱导：将步骤(1)获得的无菌苗，切取0.5-1cm带柄子叶作为外植体，接种到MS诱导培养基上进行不定芽诱导30d后获得2-3cm不定芽，所述MS诱导培养基为MS+6-BA 5.0mg/L+IAA 0.5mg/L+AgNO₃ 3.0mg/L；

(3)不定芽的伸长：将步骤(3)的不定芽从外植体切分并转移至伸长培养基中培养20d，获得长度为4-5cm的伸长不定芽，所述伸长培养基为MS+6-BA2.5mg/L+IAA 0.8mg/L+GA₃ 3.0mg/L+AgNO₃ 3.0mg/L；

(4)不定芽的生根及炼苗：将步骤(3)中伸长不定芽从愈伤组织上切分并接种到生根培养基中诱导生根，待生根苗株高至8-10cm，去瓶盖置于室温自然光照下炼苗1天，将再生苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，移栽至由品氏营养土中，所述生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mg/L。

优选地，步骤(1)中低温浸泡具体在4℃环境下置放24h。

优选地，步骤(1)中灭菌处理具体包括将种子用75％的乙醇震荡1min，用无菌水冲洗后，用10％-15％次氯酸钠溶液摇晃15min，用无菌水冲洗5次后将消毒后的种子置于无菌滤纸上吸干水分，次氯酸钠浓度低于10％脱毒效果差，污染率高；次氯酸钠浓度大于15％，种子发芽率降低。

优选地，步骤(1)中，辣椒无菌苗的苗龄为20-25d。