[发明专利]基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法：(1)制备通用桥连磁珠：a)制备磁珠‑链霉亲和素交联物；b)制备生物素‑Ab2交联物；c)制成通用桥连磁珠：将磁珠‑链霉亲和素交联物与生物素‑Ab2交联物混合孵育，制得通用桥连磁珠；(2)制备特异捕捉磁珠：将通用桥连磁珠与待测病原微生物的鼠源性Ab1混合，即得；(3)将待测样品与特异捕捉磁珠混合、孵育，磁分离洗涤，得到免疫磁珠分离物；(4)加入脱磁液孵育，磁分离，取上清涂片，加细菌染液或真菌染液，检测观察菌体着色状况。还公开了一种试剂盒，包括前述的特异捕捉磁珠、脱磁液、细菌染液和\或真菌染液。能够对样本中多种病原同步。

技术领域

本发明涉及体外生物检测诊断技术领域，具体涉及一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒。

背景技术

微生物学检测是判定病原感染、卫生状态的确证性方法，检测结果关乎临床选药及卫生决策。检测过程主要包括病原分离、鉴别、药敏试验三大环节。其中病原分离是基础，是后续检测的前提；病原鉴别是关键，可避免选药的盲目性；药敏性测试是目的，利于个性化精准用药。病原微生物的分离方法主要包括划线分离、免疫磁珠分离、微流控分离等，以划线分离培养法为主。

划线分离培养法是借助划线将标本中混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，使单个菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离获得纯种菌的目的。需经后续培养观察是否出现目的菌的单个菌落才能确认，耗时长，单个菌落出现有随机性，不能代表感染病原菌的总体状况；微流控分离快速、准确，可分离出感染病原菌总体，但需特殊装置及试剂，成本高，难于临床普及；免疫磁珠分离具备微流控分离的优点，且设备要求不高，易于自动化，耗材成本低，有利于临床普及。

常规用于病原菌鉴别的分析技术包括生化代谢谱、酶谱、质谱等，这些技术需要的目的菌量大，需将分离的目的菌培养扩增后方可进行，而培养扩增耗时长，无法实现快速诊断及早期、及时、精准选药。荧光染色鉴别需要目的菌量极少，具有快速、直观、灵敏、可自动化等优点，可用于免疫磁珠分离病原菌的直接鉴别。吖啶橙是一种水溶性的核酸荧光染料，与DNA结合时发出黄绿色荧光，与RNA结合时发出橙色荧光，与碘化丙啶组合使用可区分细胞的活性状态。羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯具有亲脂性，本身不发出荧光，在活细胞内能被酯酶分解生成羧基荧光一种新型的活细胞荧光显色剂。荧光增白剂28能与真菌几丁质特异结合而发出荧光，使整个真菌菌体着色，常用于真菌鉴别。

随着磁分离免疫技术的应用，近年人们对病原菌的免疫磁珠分离方法进行的多种尝试，并得出以下结论：纳米级磁珠比微米级磁珠对病原菌的分离效果更好；可用病原特异的多克隆抗体或单克隆抗体偶联到磁珠表面制成免疫磁珠；可用直接法或用间接法将特异抗体与磁珠偶联；在生物素与抗体间增加长链物质，可解决抗体结合病原菌时的空间位阻问题。

但直至目前，通过免疫磁珠法分离病原菌仍未获得认可和普及，主要原因为：1)分离一种病原就需特制一种专用免疫磁珠，而免疫磁珠制备过程复杂、技术难度大、抗体活性在偶联过程中损失大、偶联抗体量不足，质量很难保证；2)病原分离的纯度仅达到“富集”水平，为获得纯目的菌仍需划线分离培养，既不省时也不省力，反而增加了检测成本；3)无法对样本进行多种病原的同步化、自动化分离。在免疫磁珠与荧光染色结合的方法上也存在一些限制应用的问题，主要有：1)如何突破检测一种病原需要一种荧光标记抗体的局限；2)如何使荧光染料快速进入菌体内，实现快速染色鉴别；3)如何使病原菌表面结合的纳米磁珠脱落，以便观察菌体胞内荧光。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒。

为了实现本发明目的本发明采用的技术方案是：

一种基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法，包括如下步骤：

(1)制备通用桥连磁珠：