[发明专利]基于滚环扩增DNA酶和共价有机骨架的电化学-ELISA免疫传感器

说明书

本发明公开了基于滚环扩增DNA酶和共价有机骨架的电化学‑ELISA免疫传感器，属于电化学检测技术领域。本发明将电化学方法与酶联免疫吸附测定相结合，在酶标板上放大核酸信号，用功能纳米材料修饰电极，在0.5ng/mL～80ng/mL范围内还原峰的电信号与黄曲霉毒素M1的浓度具有线性相关性，相关系数为0.993，检测限为0.15ng/mL(S/N＝3)。本发明既能够避免传统电化学分析中电极的钝化，还能够有效地放大ELISA的信号，实现级联信号放大，降低检出限，实现痕量检测，建立了一种灵敏、高选择性、高通量的电化学酶联免疫分析方法。

技术领域

本发明涉及基于滚环扩增DNA酶和共价有机骨架的电化学-ELISA免疫传感器，属于电化学检测技术领域。

背景技术

酶联免疫吸附法(ELISA)依靠抗原和抗体的特异性识别，具有特异性强、稳定性好、操作简便等优点，已广泛应用于食品分析、环境、医药等领域，成为多种样品同时检测的金标准。然而，传统的ELISA通常采用生物酶(通常为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)作为催化剂来催化有色物质的产生，并用分光光度计读取信号，这限制了检测的灵敏度，不能满足对痕量物质检测的需要。电化学生物传感器由于电化学方法的高灵敏、操作简便、以及结合纳米材料与核酸信号放大等放大策略，可实现对痕量物质的检测。但是目前报道的电化学生物传感器通常在电极表面进行核酸信号放大，这会导致电极钝化和阻抗值增加，从而影响电极信号。所以将电化学方法与ELISA联用可在实现特异性检测的同时提高灵敏度，是一种很有前景的分析技术。如Ge等在酶标板上完成滚环扩增，产生长链DNA，利用标记有蔗糖酶的DNA(与产生的长链DNA互补)催化蔗糖转化为葡萄糖，通过血糖仪进行读数用于检测甲胎蛋白，检测限达到0.087ng/mL。该方法虽然对ELISA进行了核酸信号放大，但是其信号仍来源于生物酶(蔗糖酶)，生物酶不仅成本高，而且易失活，且血糖仪的检测范围存在一定的局限性。

因此，开发一种准确、灵敏且能够适用于痕量物质检测的方法是有迫切需求的。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于滚环扩增DNA酶和共价有机骨架的电化学 -ELISA免疫传感器，将电化学方法与酶联免疫吸附测定相结合，在酶标板上放大核酸信号，用功能纳米材料修饰电极，既能够避免传统电化学免疫分析中电极的钝化，还能够有效地放大ELISA的信号，降低检出限，实现痕量检测。

本发明的第一个目的是提供一种电化学-ELISA免疫传感器，所述电化学-ELISA免疫传感器是在引物-金纳米粒子-适配体复合物/抗原目标物/抗体三明治结构修饰的酶标板中进行滚环扩增，扩增产物经折叠形成DNA酶，然后加入含邻氨基酚的溶液中，同时将经过共价有机骨架纳米材料修饰的电极也浸入溶液中。

在本发明的一种实施方式中，所述共价有机骨架纳米材料为COFs-TpBD。

在本发明的一种实施方式中，所述用于滚环扩增的引物-金纳米粒子(AuNPs)-适配体复合物/抗原目标物/抗体三明治结构修饰的酶标板的制备方法包括如下步骤：

(1)引物-AuNPs-适配体复合物的制备：利用AuNPs与含巯基的适配体、含巯基的引物制备得到引物-AuNPs-适配体复合物；

(2)制备引物-AuNPs-适配体/抗原目标物/抗体三明治结构修饰的酶标板：在含有相应抗体的酶标板上加入抗原目标物，然后加入引物-AuNPs-适配体复合物，形成引物-AuNPs-适配体/抗原目标物/抗体三明治结构修饰的酶标板。

在本发明的一种实施方式中，对引物-AuNPs-适配体/抗原目标物/抗体三明治结构修饰的酶标板进行滚环扩增反应。