[发明专利]球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法

说明书

本发明公开了球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，包括：将培养有球形孢子丝菌的培养基离心，收集菌株沉淀；将菌株沉淀与裂解缓冲液混合，超声，离心，收集第一上清液；将第一上清液与十六烷基三甲基溴化铵混合，静置，离心，收集第二上清液；将第二上清液与硼酸混合，静置，离心，收集第三上清液；将第三上清液过刀豆球蛋白亲和层析柱，洗脱，收集洗脱液。本发明的提取方法不影响抗原的活性，得到的抗原纯度高。

技术领域

本发明涉及微生物抗原提取领域。更具体地说，本发明涉及一种球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法。

背景技术

孢子丝菌病(sporotrichosis)是由双相型暗色真菌申克孢子丝菌(Sporothrixschenckiisensulato，下文简称Ss.)感染引起的最常见的深部真菌病。Ss.在环境中为菌丝相，寄生或腐生于植物或土壤中；而感染机体后，病灶中为酵母相。Ss.感染可形成难以自愈的慢性感染，不仅累及皮肤，也可通过淋巴管途径感染脏器，发生播散的、系统的致命性感染。目前的研究表明，孢子丝菌感染人体或动物后，其胞壁抗原可刺激机体产生抗体，此种抗原-抗体反应作为开发体外诊断试剂的基础依据。因此，亟需设计一种提取球形孢子丝菌胞壁抗原的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，其不影响抗原的活性，得到的抗原纯度高。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，包括：

将培养有球形孢子丝菌的培养基离心，收集菌株沉淀；

将菌株沉淀与裂解缓冲液混合，超声，离心，收集第一上清液；

将第一上清液与十六烷基三甲基溴化铵混合，静置，离心，收集第二上清液；

将第二上清液与硼酸混合，静置，离心，收集第三上清液；

将第三上清液过刀豆球蛋白亲和层析柱，洗脱，收集洗脱液。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，所述培养基的制备方法包括：

将蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、氯化钠、葡萄糖及磷酸氢二钠与蒸馏水混合，调节pH至7.4±0.2，灭菌。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，裂解缓冲液的成份包括十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、乙二胺四乙酸，pH为8.0±0.5。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，将菌株沉淀与裂解缓冲液的混合液用80～120W的细胞破碎仪进行超声，超声时间10～50min。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，在将菌株沉淀与裂解缓冲液混合之前，用磷酸盐-吐温缓冲液洗涤菌株沉淀。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，磷酸盐-吐温缓冲液的制备方法包括：取磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾，加浓盐酸调pH至7.4，然后加入Tween 20。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，将第二上清液与硼酸混合，调pH至8.5，静置，离心，收集第三上清液，并将得到的沉淀用无水乙醇重悬，离心，收集上清，并合并入第三上清液。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，在过刀豆球蛋白亲和层析柱之前，用平衡缓冲液平衡刀豆球蛋白亲和层析柱；

平衡缓冲液的制备方法包括：取Tris碱、氯化钠、氯化锰和氯化钙，调节pH至7.4，加水。

优选的是，所述的球形孢子丝菌胞壁抗原的提取方法，在过刀豆球蛋白亲和层析柱后，用平衡缓冲液冲洗，冲洗至流出液在280nm的紫外吸收不大于0.001。