[发明专利]一种聚乙二醇修饰尿酸酶的方法

说明书

本发明属于生物技术及制药领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，包括如下步骤：将尿酸酶液溶解在碳酸盐缓冲液中，加入PEG修饰剂及赖氨酸，4～30℃下搅拌反应60～240min，反应结束后经超滤浓缩、分子筛纯化即可得高纯度聚乙二醇化尿酸酶。本发明在修饰过程中加入赖氨酸，有效提高了PEG修饰尿酸酶的均一度，并且降低了PEG修饰剂的用量，有效减少了PEG的降解。本发明聚乙二醇化尿酸酶的制备方法简单、原料利用率高、酶活回收率高，处理量大，适合规模化生产。

技术领域

本发明属于生物技术及制药领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰尿酸酶的方法。

背景技术

尿酸酶又称为尿酸氧化酶，他能催化尿酸氧化成尿囊素、二氧化碳和水。具有功能的尿酸酶存在于大部分生物体内，但是随着进化灵长类体内的基因突变导致尿酸氧化酶合成的功能丢失。因此，人体内任何嘌呤分解代谢的增加或尿酸排泄的减少都会导致尿酸浓度的增加，血液中尿酸的浓度大于7mg/dl(女性6mg/dl)时会引起高尿酸血症，高尿酸血症进一步发展就会导致尿酸在体内关节处的积累，进而形成痛风。在高尿酸血症和痛风的治疗方法中，利用不同的方法重组的尿酸酶能够快速有效降低患者血液中的尿酸，对于重度尿酸血症患者、难治性痛风患者以及肿瘤溶解综合征患者均具有较好的疗效。

但是由于尿酸酶的免疫原性比较大，并且在体内的半衰期短，所以为了降低免疫原性和延长半衰期，可以对其化学修饰。常用的蛋白修饰剂为聚乙二醇(PEG)，PEG修饰是在体外将PEG共价连接在蛋白质药物上，以达到降低免疫原性和增加半衰期的效果。聚乙二醇是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过共价键结合方式修饰蛋白质。经PEG修饰后蛋白药物的免疫原性降低，而且能够提高蛋白的溶解性和稳定性，减少肾脏的清除延长药物的半衰期。目前，FDA已经批准了多种PEG修饰重组蛋白药物上市。例如CN1322141A公开的一种采用PEG修饰的是PEG饱和修饰重组猪和狒狒的尿酸酶。

对于PEG饱和修饰的尿酸酶，为了能够做到饱和修饰需要加入过量的PEG。这就使得PEG的使用量很大，同时，由于反应条件的问题，容易造成PEG降解严重。文献International Journal of Pharmaceutics 387(2010)215–222中，尿酸酶的浓度为1mg/ml，PEG与尿酸酶摩尔比为370:1根据其电泳实验结果，在这个修饰条件下有部分尿酸酶没有修饰，而且修饰均一度低，并且修饰度也低。专利CN 102634492A中，尿酸酶的蛋白浓度为4mg/ml，PEG与尿酸酶摩尔比为40:1～160:1，根据其实验结果在试验范围内随着PEG使用量的增大，修饰度增加，同时修饰均一度也有所增加，但是当PEG加入量继续增大，虽然俢饰度增加但是不能达到饱和修饰，也并不是随着PEG使用量的增大，PEG修饰的均一度能进一步有效的提高。因此，需要提供一种PEG用量小，修饰均一度高的PEG饱和修饰尿酸酶的方法。

发明内容

为了解决现有技术中PEG饱和修饰尿酸氧化酶过程中均一度差、PEG使用量大的缺陷，本发明提供一种聚乙二醇修饰尿酸酶的方法。

本发明的技术方案如下：

一种聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，包括如下步骤：将尿酸酶液溶解在碳酸盐缓冲液中，加入PEG修饰剂及赖氨酸，4～30℃下搅拌反应60～240min，反应结束后经超滤浓缩、分子筛纯化即可得高纯度聚乙二醇化尿酸酶。

优选地，所述尿酸酶液的浓度为3～8mg/ml，更加优选为4～6mg/ml。

优选地，所述碳酸盐缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，其中盐离子浓度为0.04～0.5mol/L，更加优选为0.1～0.2mol/L。

优选地，所述碳酸盐缓冲液pH8.0～10.5，更加优选为8.5～9.0。