[发明专利]麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体

说明书

本发明公开了麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供了一系列酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体。突变体T439A、T439A/Q585R、T439A/G586D麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活分别为野生酶的2.1倍、2.4倍、2.7倍。

本申请是原申请号为201710822065.8、申请日为2017年9月13日，发明名称为一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)由两个吡喃葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性寡糖，同时具有高度安全性和有良好的稳定性，被广泛应用于医药、食品、化妆和农业等领域。自1995年以来，日本、美国和欧盟等先后批准海藻糖可以用作食品添加剂。2005年，我国卫生部正式批准海藻糖为新资源食品。

1993年日本林原生化研究所首次发现麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以液化淀粉作为底物，这两种酶协同作用，可以生成海藻糖，并且率先实现了海藻糖工业化生产。目前，我国已有公司开始生产海藻糖，但产品性能、产率与进口产品存在一定差距，并且生产成本一直居高不下。更为严峻的是，为了迎合市场需求，海藻糖售价不断下降，给海藻糖生产带来了巨大挑战和压力。因此如何提升海藻糖产率，实现海藻糖低成本规模化制备，使其走向大众消费者的餐桌成为学术界和产业界关注的热点。

目前，工业化生产海藻糖主要通过两种方法：①利用海藻糖合成酶，以麦芽糖作为底物，通过分子内转糖基作用，生成海藻糖；②以淀粉液化液作为底物，经麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖。两种方法海藻糖产率均为80％左右。但是，从生产成本以及周期考虑，以淀粉作为底物制备海藻糖，工艺更为简便，成本更为低廉。因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖，更具优势。

国内外双酶法生产海藻糖包括中低温酶系(海藻糖转化率：Arthrobactersp.Q36：80％、Arthrobacter ramosus S34：66％，Brevibaterium helvolum：70.4％)和高温酶系(Sulfolobus solfataricus KM1：81.5％、Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909：80.2％)。高温酶系通常具有较高的海藻糖转化率，并且具有良好的热稳定性，能在较高温度下转化淀粉生成海藻糖，不容易在生产过程中污染杂菌。但是，高温酶系相对于中低温酶系，具有蛋白表达量低，比酶活低的缺点，不利于其工业化应用。

发明内容

基于上述现状，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活，为其工业化生产创造条件。

本发明提供了具有酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的突变体，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第81、263、284、432、439、583、585、586、611或615位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。这些突变体与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比，酶活提高。

在本发明的一种实施方式中，所述嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser)，突变体命名为G81S。