[发明专利]一种HBV cccDNA与宿主互作研究模型构建及应用

说明书

本公开属于生物工程技术领域，具体涉及一种HBV cccDNA与宿主互作研究模型构建及应用。本公开提供了一种高度模拟乙型肝炎病毒基因组cccDNA的微环DNA模型构建及其应用，通过构建pmini‑MC‑HBV‑Intron质粒，体外获得高纯度MC‑HBV微环质粒；通过优化嵌合内含子序列和RNA的二级结构，实现了嵌合内含子在RNA水平上的高效可变剪接，获得可体外高水平复制的MC‑HBV。该MC‑HBV可高度模拟HBV病毒与宿主细胞间的生理活动。本公开还建立了体外标记MC‑HBV模型和检测的技术，为揭示HBV cccDNA与宿主相互作用关系、功能调节机制和探寻HBV治疗新靶点的提供了极好的模型。

技术领域

本公开属于生物工程技术领域，具体涉及一种构建可支持HBV高水平持续复制的HBV cccDNA微环模型(MC-HBV)的方法及利用多种标记方法探究cccDNA与肝细胞相互作用研究的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

乙型肝炎病毒简称乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，其慢性感染与肝硬化及肝癌关系密切，是肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最为重要的诱发因素。HBV基因组为松散环状DNA(RC-DNA)，在感染宿主胞核中形成共价闭合的环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，并结合宿主细胞组蛋白、病毒核心蛋白等以微小染色体形式存在。cccDNA作为模板，形成为前基因组RNA(pgRNA)；以pgRNA为模板，在HBV逆转录酶作用下，形成子代rcDNA，并在肝细胞质中装配形成完整的HBV，并释放出肝细胞，进入血液中；肝细胞质中的rcDNA也可再进入肝细胞核，再次形成cccDNA，继续同样的过程复制。这样，由于cccDNA的存在，使得病毒无法彻底清除，是慢乙肝无法治愈的真正原因。

cccDNA是HBV转录的唯一模板和体内病毒储存库，也是HBV持续存在的主要原因，目前重组干扰素及核苷类似物等抗病毒治疗手段难以清除cccDNA，对cccDNA与宿主相互作用规律的认识也知之甚少。建立高度模拟HBV cccDNA且支持HBV复制的良好模型，并解析cccDNA与宿主相互作用机制尤为迫切，而目前常用的HBV表达载体多大于1.0拷贝，且携带很多外源载体序列，转染肝细胞产生cccDNA拷贝数也较低，严重制约了cccDNA相关机制研究的开展。

目前HBV感染性克隆模型主要包括1.0拷贝的表达质粒(如HBV1.2、HBV1.3表达质粒)和新近开发的cccDNA微环载体质粒(包括prcccDNA/pCMV-Cre系统、HBVcircle系统)，prcccDNA/pCMV-Cre系统产生的重组rcccDNA(recombinant cccDNA)转录pgRNA经可变剪接后，可产生野生型的cccDNA，但rcccDNA获得需prcccDNA和pCMV-Cre质粒共转染肝细胞系，存在转染率低、产生cccDNA拷贝数少的缺点，限制其进一步应用。HBVcircle系统虽体外高度模拟cccDNA，但其基因组残余的attR序列无法去除，在子代病毒中一直存在，存在潜在的未知影响。另外，目前并没有建立HBV cccDNA直接标记与检测的方法，从而限制HBV cccDNA与肝细胞相互作用的探究。体外可大量获得高度模拟且直接标记检测的cccDNA质粒，体内可产生与亲代一致的子代病毒的HBV cccDNA模型，对HBV cccDNA与宿主互作研究及cccDNA特异性治疗靶点的开发具有重要的意义。

发明内容