[发明专利]一种去泛素化酶的活性检测方法

说明书

本发明公开了一种去泛素化酶的活性检测方法，包括以下步骤：S1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光；S2、配制含有10mM DTT的1X反应缓冲液，并以含有10mM DTT的1X反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液；与传统荧光分析法相比，本发明中的化学发光方法表现出更宽的线性范围，更高的灵敏度和更低的检测限，因此能获得更高可靠性的检测数据；在获得同等结果的前提下，通过氨基荧光素标记泛素(Ub‑AML)作为发光底物所需要的酶量，低于传统荧光法所需酶量几百甚至几千倍，从而极大的降低了高通量药物筛选的成本。

技术领域

本发明属于去泛素化酶技术领域，具体涉及一种去泛素化酶的活性检测方法。

背景技术

去泛素化酶是一类数量很大的蛋白酶，在许多筛选实验室中，目前使用二十年前建立的基于稳态荧光的测定方法测量去泛素化酶的活性。该方法使用的荧光底物，例如7-氨基-4-甲基香豆素标记泛素蛋白(Ub-AMC)，或罗丹明110标记泛素蛋白(Ub-Rho)。这些底物被各种去泛素化酶有效裂解或水解，释放出高度荧光的部分。该测定已用于各种去泛素化抑制剂筛选，例如用于鉴定USP1和USP7抑制剂。

有一个显著的缺点，特别是对于Ub-AMC，是它们易于受到许多小分子表现出的荧光所干扰；另外，由于这些底物中泛素与荧光基团的连接与生理条件下形成的泛素结合物中的异肽键结构差异较大，以至于很多去泛素化酶对它们的识别和处理速率非常慢，从而大大降低了该测量方法的灵敏度和实验数据的可靠性的问题，为此我们提出一种去泛素化酶的活性检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去泛素化酶的活性检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种去泛素化酶的活性检测方法，包括以下步骤：

S1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光；

S2、配制含有10mM DTT的1X反应缓冲液，并以含有10mM DTT的1X反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液；

S3、在白色96孔板中，加入以下体积组分以获得20ul的总反应体积的混合液：a-10ul 1X反应缓冲液；b-5ul去泛素化酶工作溶液；c-5ul底物工作溶液；

S4、将白色96孔板稍作离心使各组分溶液聚集到孔底充分混匀，将S3所得混合液反应置于室温孵育25-35分钟；

S5、在白色96孔板每孔中加入20ul荧光素检测试剂，然后将白色96孔板置于摇床上摇晃2分钟,之后将白色96孔板置于室温继续孵育30分钟；

S6、读盘，记录每孔的发光值。

优选的，所述底物为氨基荧光素标记泛素(Ub-AML)，且所述底物浓度为0.6uM。

优选的，所述S2中含有10mM DTT的1X反应缓冲液是在S1中解冻后的反应缓冲液的基础上进行稀释得到。

优选的，所述去泛素化酶包括半胱氨酸和金属蛋白酶类别的所有六个去泛素化酶家族。

优选的，所述S2中去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液均通过将含有10mM DTT的1X反应缓冲液分别倒入盛有去泛素化酶与底物的玻璃器皿中制得。