[发明专利]一种参与丹参酮生物合成的丹参CYP71BE37的基因克隆引物、功能及应用

说明书

本发明公开了丹参中一条参与调控丹参酮合成的细胞色素P450基因CYP71BE37的编码基因序列；本发明所提供的CYP71BE37基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明检测了CYP71BE37在丹参组织中的表达情况，发现其在丹参花和根的周皮部高丰度表达；构建了CYP71BE37‑RNAi载体及CYP71BE37‑过表达(CYP71BE37‑oe)载体，通过发根农杆菌介导的丹参遗传转化获得转基因毛状根阳性株系；超高效液相色谱(UPLC)检测分析发现，在CYP71BE37‑RNAi株系中，丹参酮类化合物含量显著降低，而在CYP71BE37‑oe株系中，丹参酮类化合物含量升高。本发明提供的CYP71BE37具有催化产生丹参酮类化合物的能力，为利用生物技术手段提高丹参酮类化合物的含量奠定基础。

技术领域

本发明属于植物分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种参与调控丹参酮生物合成的CYP71BE37的基因克隆和功能研究。

背景技术

中药丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎，是最常用的大宗药材之一。丹参具有扩张冠脉、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、清除自由基和保护心肌、改善微循环和血液流变、治疗痛经、抗肿瘤、抗炎、保肝以及抗菌等药理作用。丹参酮类化合物和丹酚酸类化合物是丹参的主要活性成分。其中，丹参酮类化合物主要分布于丹参根及根的周皮中，包括二氢丹参酮I(DT-I)、隐丹参酮(CT)、丹参酮I(T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)等，在治疗心脑血管疾病方面发挥重要作用。丹参酮为二萜类化合物，其生物合成途径可分为三部分，第一部分是萜类化合物前体异戊烯基二磷酸(IPP)和烯丙基二磷酸(DMAPP)的合成；第二部分是丹参酮骨架化合物——次丹参酮二烯的合成；第三部分是骨架化合物的修饰过程，包括氧化、甲基化、脱羧等。目前，丹参酮生物合成途径研究已取得一定进展，但仍未被彻底阐明，主要是仍有大量参与丹参酮骨架化合物氧化的关键酶(主要为细胞色素P450)仍未被鉴定。

细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是一种血红蛋白结合蛋白，具有单加氧酶活性，是植物基因组中最大的超基因家族之一，也是参与植物次生代谢途径最大的氧化酶超家族，具有复杂的底物选择性和催化活性。CYP450在自然界以单体或二聚体的形式普遍存在，参与植物中多种化合物的修饰，特别是多结构类型的萜类化合物的生物合成。随着分子生物学及相关生物技术的不断发展，CYP450在植物次生代谢途径中的功能正在逐步得以验证。近年来，利用异源表达和RNA干扰等技术使得CYP450在紫杉酚、青蒿素、植物抗毒素等代谢途径中的重要作用逐渐被解析。

近年来，丹参酮类化合物的生物合成途径被初步解析，三个参与丹参酮类化合物结构修饰的CYP450基因CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1得到功能验证，其中，CYP76AH1催化次丹参酮二烯合成铁锈醇；CYP76AH3催化铁锈醇可以同时合成11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚。CYP76AK1可分别羟基化11-羟基铁锈醇和11-羟基柳杉酚的C20位点生成11，20-二羟基铁锈醇和1，20-二羟基柳杉酚。据推测的丹参酮生物合成途径，仍会有其他CYP450参与丹参酮的生物合成过程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与调控丹参酮生物合成的细胞色素P450基因CYP71BE37的基因及其编码的蛋白质。

本发明提供的CYP71BE37基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的CYP71BE37基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明设计出了扩增CYP71BE37基因特异性片段的引物，其碱基序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。