[发明专利]一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用

说明书

本发明涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用。所述冷冻保护液包括：L‑脯氨酸和海藻糖，所述L‑脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4～10:1。本发明所提供的细胞冻存液采用生物相容性更好的L‑脯氨酸和海藻糖，在使用时可以直接将冻存管保存于液氮中，节省大量时间，同时可以保证较高的细胞复苏率，特别是红细胞，可以达到80～90％；本发明细胞冻存液冻存后的细胞形态结构和生理功能维持稳定，细胞膜上的各功能性蛋白活性保持不变。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用。

背景技术

细胞冻存是现有生物学领域的一项常规技术，在购买的细胞经过传代后，一般需要将其中的一部分冻存起来，以作备用，可以用来重复实验，也可以在需要时复苏细胞，一部分拿来实验，另一部分继续传代冻存，是实验室的一种资源。同时也有很多实验在构建特定的细胞株后需要冻存一部分，以便重复使用。细胞在冻存时大量水分从细胞器中渗出，在低温条件下形成冰晶，从而对细胞本身造成损害。

现有技术为了克服细胞在低温状态下易形成冰晶的缺陷，在细胞冻存液中使用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，提高细胞膜对水的透过性，细胞在低温条件下，部分水分渗出，形成的冰晶较少；同时，细胞在冻存时需要采用“慢冻速融”的方法，以便于细胞内的水分可以充分地渗出，避免形成较大的冰晶。但是，现有冻存方法仍存在着一定的缺陷，以此方法冻存的细胞难免在结构和功能方面出现损伤，在复苏时，往往一部分细胞仍会死亡，而存活下来的细胞有时也需培养一段时间后恢复状态和活性。

而对于某些较为脆弱的细胞，由于其本身特殊的性质，在其冻存过程中细胞冻存液和冻存方法的选择更为重要，例如红细胞，红细胞目前被广泛用于外科手术补充失血和治疗贫血等疾病中。目前各大血站通常采用ACD，CPD，CPDA-1保存液将血液保存在4℃下，虽然能够基本保证一般情况下的临床用血需求，但是这种传统的保存方法保存时间短，通常可以保存3周，运输困难且受气温影响比较大，对于紧急情况下的大量用血以及偏远地区的用血需求就难以保障。此外，目前有采用甘油低温冷冻保存方法，能够保存红细胞长达10年之久，但是由于需要高浓度的甘油来保障红细胞经历降温及升温过程后仍然存活，所以在复苏红细胞后需要一系列复杂的耗时耗力的去甘油化过程，红细胞才能被用于输注。

发明内容

本发明提供一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用，用以解决现有技术中细胞冻存步骤繁琐，冻存后细胞结构和功能难以保持的问题。

第一方面，本发明提供一种冷冻保护液，包括：L-脯氨酸和海藻糖，所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4～10:1。

L-脯氨酸可以渗透到细胞内，减少细胞酸性，调整细胞的氧化还原势能，稳定蛋白质及其他生物大分子，海藻糖的性质十分稳定，可以在细胞膜表面形成保护膜，有效保持蛋白质分子不变形，维持细胞的生命特征和生物过程。本发明将此两者进行搭配，并限定其浓度使得其制成的冻存液效果在很大程度上得到提升，在冻存细胞时减少形成冰晶的数量和大小，可以不用常规的“慢冻”过程，直接置于液氮中保存也可以保持较高的细胞存活率。

进一步地，所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4～8:1。

进一步地，所述L-脯氨酸和所述海藻糖在细胞冻存液中终浓度为：L-脯氨酸1～2mol/L，海藻糖0.2～0.3mol/L。

第二方面，本发明提供一种细胞冻存液，包括上述冷冻保护液和基础液。

进一步地，所述基础液为PBS、0.9％NaCl、1×DMEM basic和杜氏磷酸缓冲液中的一种或多种，优选为杜氏磷酸缓冲液。