[发明专利]一种苹果轮纹病菌的接种方法

说明书

本发明公开了一种苹果轮纹病病菌的接种方法，包括苹果轮纹菌液获得，菌液接种苹果果实，最后接种枝条。其中PDA液体培养基配方为马铃薯200g；葡萄糖20g；蒸馏水1000mL。本发明的有益效果是能够补充或者替代目前多数研究中用菌饼接种苹果轮纹病的方法，可以大量而且准确地接种，具有简单、高效的特点。

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种苹果轮纹病菌的接种方法。

背景技术

目前，苹果轮纹病成为严重限制我国苹果产业健康持续发展的重要因素之一。2008年，对山东等我国7个苹果主产省市的88个果园调查结果显示，苹果轮纹病总体发病率为77.6％，其中山东省、河南省发病率均高达100％。轮纹病菌侵染枝干，形成病瘤，粗皮以及干腐状病症，严重影响树势，最终可导致树体或者枝条死亡；轮纹病菌侵染果实，严重时果实腐烂，导致产量和品质严重下降。据报道，一般年份，常规园采收的果实病果率为12-20％，常温下贮藏1个月后，病果率可达50-60％。苹果轮纹病菌不仅侵染田间生长的苹果，而且由于其潜伏侵染特性，还可引起苹果采后腐烂，成为贮藏期的重要病害。因此，苹果轮纹病被认为是80年代以来最严重的烂果病害之一，给果农及苹果产业造成了巨大的损失。亟待研发更好的防控措施，以促进我国苹果产业健康稳定发展。

研发病害防控措施的必要手段是借助于人工接种技术。而获得大量的孢子是人工接种的第一步。孢子可以通过洗涤气生菌丝，或者振荡培养等简易方法获得。但是苹果轮纹病的病原菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria spp.)一般条件下不易产生孢子。其常规的产孢方法是将病原菌接种在PDA培养基上，刮伤菌丝，紫外光(254nm)或黑光(365nm)照射。也可以接种幼果，转入黑光灯下培养获得。但是这些方法诱导时间长，并且需要一定的设备条件，诱导产孢量少,且效果不稳定,难以满足大批量接种试验的需求。这影响了对其生物学特性、致病机理和药剂毒理的研究，继而也影响了该病防控措施的研发。

目前由于苹果轮纹病病菌诱导孢子比较困难，因此大多数报道的相关研究中用PDA培养基上获得的菌饼替代孢子进行人工接种。为此，我们发明了一种补充或者替代菌饼接种的方法，可以大量而且准确地接种，进行相关研究。该技术具有简单、高效的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果轮纹病菌的接种方法，本发明的有益效果是能够补充或者替代目前多数研究中用菌饼接种苹果轮纹病的方法，可以大量而且准确地接种，具有简单、高效的特点。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：苹果轮纹菌液获得：

在超净工作台中，取无菌PDA液体培养基加入高温灭菌的三角瓶中，用无菌的尖头小镊从平板上培养的苹果轮纹病菌上挑取少许菌丝，放入三角瓶中，用封口膜封好，置于摇床中培养，苹果轮纹病菌菌丝产生菌丝球状物；在超净工作台中，取无菌PDA液体培养基加入无菌离心管，再从三角瓶中的培养物中夹取两三个菌丝球状物放入离心管中；取一大烧杯，加满冰块，将上述离心管插入冰块中并固定于烧杯中；将烧杯放入超声波细胞细胞破碎仪的隔音箱中，用酒精棉球擦洗探头，将探头没过液体，将菌丝球状物破碎为乳液状；

步骤2：菌液接种苹果果实：

选取大小一致、无损伤的富士苹果果实，将果实用酒精擦拭进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，室温风干；在赤道处相对位置用打孔器打两个孔，用移液枪吸取破碎的菌液加入一个孔中，另一个孔中加等量的PDA液体培养基做对照；将处理和对照分别用保鲜膜缠好，装入纸箱中培养，观察发病情况；

步骤3：接种枝条：

选取枝条嫩梢，洗净后用酒精消毒，无菌水冲洗，在枝条上用尖头小镍将嫩梢刺伤；吸取破碎的菌液加入嫩梢的一个刺伤部位；在另一个伤口处，加入等量的液体PDA培养基作对照，将处理和对照用保鲜膜缠好，嫩梢底部用脱脂棉包住，然后在脱脂棉上加入无菌水；放入托盘中，将托盘用保鲜膜覆盖培养，观察发病情况。