[发明专利]一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用

说明书

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用。本发明从短须裂腹鱼的肝脏提取总RNA，反转录得到cDNA第一条链，采用RACE扩增法进行超氧化物歧化酶基因5'‑和3'‑序列的克隆，利用软件对克隆得到的中间序列、5'‑和3'‑序列进行拼接成为Cu/Zn‑SOD cDNA全长序列。该序列共801bp，包括完全开放阅读框465bp，5'‑UTR为60bp，3'‑UTR为276bp。本发明首次公开了短须裂腹鱼超氧化物歧化酶基因全序列及其全序列的克隆方法。同时，为深入研究短须裂腹鱼的超氧化物歧化酶的抗氧化分子机理提供理论依据。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,EC1.15.1.1)是广泛存在于生物体的重要抗氧化酶之一，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应生成过氧化氢和水，平衡机体氧自由基水平，避免活性氧簇(ROS)的毒害作用，Cu/Zn-SOD是最早被发现的超氧化物歧化酶，约占SOD总量的90％，主要存在于真核细胞的细胞浆内。当水生动物受到胁迫时，其体内产生氧化应激，并诱导ROS水平明显增加，并进一步引起水生生物体内抗氧化酶的酶活力或基因表达的变化。SOD与其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)在鱼体抗氧化过程中起重要作用，其基因表达水平或酶活力变化可反映机体的氧化损伤状况或受环境胁迫的状态。

短须裂腹鱼(Schizothorax wangchiachii)隶属于鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属，主要分布于金沙江、乌江和雅砻江；因过度捕捞、环境污染、水电开发等原因，野生短须裂腹鱼资源越来越少。目前已经开展人工养殖，由于养殖过程中养殖密度过高、水质条件(氨氮等)不合理，营养素(蛋白质、脂肪、微量元素)的不足或过剩都会影响鱼类的生长和健康。

超氧化物歧化酶作为衡量鱼类氧化损伤状况或受环境胁迫的状态的指标，是研究短须裂腹鱼生长及抗氧化性能的一种最重要的蛋白酶。但是，目前还没有关于短须裂腹鱼的超氧化物歧化酶基因的结构和表达的报道，这极大地限制了对短须裂腹鱼抗氧化防御研究的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因，其序列见SEQID NO.11。

进一步，所述基因序列共801bp，包括完全开放阅读框465bp，5'端非编码区为60bp，3'端非编码区为276bp。

进一步，所述基因序列推导编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.12。

如上述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法，包括以下步骤：

步骤1：提取总RNA并逆转录为cDNA；

步骤2：根据已知的多种动物Cu/Zn-SOD基因的保守区序列设计引物，PCR克隆Cu/Zn-SOD基因中间片段；

步骤3：获取目标基因5’端序列；

步骤4：获取目标基因3’端序列；

步骤5：将步骤2、步骤3和步骤4获得的序列片段进行拼接，获得全长序列。

进一步，步骤2中根据已知的多种动物Cu/Zn-SOD基因的保守区序列设计的引物序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

进一步，步骤3中涉及的引物序列见SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6。

进一步，步骤4中涉及的引物序列见SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9。