[发明专利]一种应用基因组重排技术筛选庆大霉素高产菌株选育的方法

权利要求书

1.一种应用基因组重排技术筛选庆大霉素高产菌株选育的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、制备0.9％ 生理盐水、20% 氯化锂溶液、邻苯二甲醛（OPA）衍生剂、试验标准品、流动相以及培养基；

S2、选育基因组重排的亲本菌株，无菌条件下，取斜面一支，加入20ml 0.9％生理盐水将孢子全部洗下，吸入带玻璃珠的锥形瓶中，220rpm 35.5℃条件下摇20min，过滤，装入50ml离心管中，震荡混匀，吸取2ml于甘油管中，4℃条件下保存；取500μl孢子悬浮液，加入250μl 20%氯化锂，250μl超纯水，振荡5min，取20μl孢子悬浮液，诱变仪诱变60s，加入980μl生理盐水，存放于灭菌的离心管中，4℃保存；

S3、基因组重排，具体包括原生质体制备、原生质体紫外灭火和热灭活以及基因组重排；

原生质体制备：取步骤S2获得的诱变孢子悬浮液5ml，接入含0.3％甘氨酸种子培养基，35.5℃培养48h，过滤收集菌丝体，用0.3mol/L蔗糖洗涤3次，P液洗涤1次后，重悬于P稳定液中,每毫升中加入6mg，37℃水浴2h左右，取样镜检，观察到大部分菌丝裂解后，用胶头滴管吹打几次，使原生质体和细胞壁分离，2000r离心10分钟用P液洗涤2次后备用；计算原生质体形成率,公式如下：

原生质体形成率=（A-B）/A；

A：酶解前直接稀释涂平板长出菌落数；

B：酶解液经无菌水稀释后涂平板长出；

原生质体紫外灭火和热灭活：紫外灭活：取原生质悬液，加入到灭菌的培养皿中，在20W紫外灯（先预热20min）下，照射距离30cm，时间2-4min，灭活原生质体；然后取灭活后的原生质体悬液稀释涂布再生平板（3个平行），用锡箔纸包裹，于35.5℃下避光培养10d，统计菌落数并计算致死率；

热灭活：取原生质悬液，加入到灭菌的1.5ml离心管中，于60℃恒温水槽中保温70-100min，灭活原生质体。

2.然后取灭活后的原生质体悬液稀释涂布再生平板（3个平行），于35.5℃下培养10d，统计菌落数并计算致死率；

同时取等量未经灭活的孢子悬浮液涂布于平板上，于35.5℃下培养10d，统计菌落数，计算灭活率；

灭活率=［(未经灭活平板菌落数×相应稀释倍数－灭活后平板菌落数×相应稀释倍数)/(未经灭活平板菌落数×相应稀释倍数)］×100%；

基因组重排：取等量的紫外灭火和热灭活后的菌丝体分别置于灭菌离心管中，3000r离心10min，弃上清，加入PEG 1000，混匀；在室温下静止一段时间，使原生质体融合，结束后立即加入5ml Ｐ缓冲液，混均后，3000r离心5min，弃上清；重复一次，适当稀释后涂布于再生培养基，35.5℃恒温培养10d；挑选较好的单菌落，利用高通量筛选方法进行产量检测，产量较高、组份较好的作为下一轮重排的亲本再按照上述呈现进行第二轮；以此类推，共进行五轮重排；

S4、数据检测，挑取培养好的平板上生长较好的菌落，加入24孔板中，35.5℃培养2天。

3.将长好的种瓶孔板对应接入发酵孔板和斜面孔板，依次培养3天和10天；向发酵孔板中加入20%硫酸酸化至PH为1.5-2.0，放入220rpm摇床上振荡30min混匀，在孔板离心机4000rpm条件下离心25min，取上清液20µL，加入160µL OPA和820µL超纯水，60℃水浴15分钟，取200µL样品加入石英板中，酶标仪检测，选取吸光度最高的进行复筛；挑选出吸光度较高的菌株，对应找到相应的斜面孔板传斜面，36℃培养9天，待斜面长好，依次接种瓶和发酵瓶；并将发酵液用浓硫酸酸化至PH为1.5-2.0，离心取上清1ml，5个标准品各1ml，加入800μlOPA、700μl甲醇，60℃水浴15min，过0.45μm滤膜，上机测组份和效价，用庆大霉素各组份的线性回归方程分别计算供试品中对应单位及组份。