[发明专利]一种维氏气单胞菌总RNA提取方法

说明书

本发明涉及一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：取处于对数生长期的维氏气单胞菌，离心，弃掉培养基，加溶菌酶，振荡均匀，其中，溶菌酶的添加量为300μL，溶菌酶的浓度介于3‑12mg/mL；加入900μL的Bμffer Rlysis‑B溶液，室温放置3分钟；加入200μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；加入上清液体积1/3的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟或在‑20摄氏度下放置30min后，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；以为700μL、浓度为75%的乙醇溶液洗涤沉淀，离心，小心倒掉上清液；室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30‑50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或‑70摄氏度长期保存。

技术领域

本发明涉及基因工程分子提取技术领域，具体涉及一种维氏气单胞菌总RNA提取方法。

背景技术

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）属革兰氏阴性菌，对环境具有较强的适应性，广泛存在于淡水及河口等环境中；维氏气单胞菌是一种重要的、兽及水生生物共患病原菌，可引起人类胃肠炎、腹膜炎、败血症和外伤感染等，严重威胁着人类健康，而且给水产养殖业造成了巨大经济损失。

因此，针对该菌中引起的相关疾病的防治工作中，及早诊断是控制疫情的关键环节，除了对症状的观察外，直接针对病原微生物的分离检测显得尤为重要。

已有许多提取革兰氏阴性菌总RNA的试剂盒，然而，利用这些试剂盒提取维氏气单胞菌时，其最终获得总RNA浓度很低，平均浓度只有20ng/μL左右，完全不能满足反转录实验体系的要求。

发明内容

为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：

步骤S1：取处于对数生长期的维氏气单胞菌，8000rpm、4摄氏度离心1分钟，弃掉培养基，加预定量溶菌酶，振荡均匀，其中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，获取菌液500μL，针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，获取菌液1-1.5mL；溶菌酶的添加量介于250-350μL，溶菌酶的浓度介于3-12mg/mL；

步骤S2：向步骤S1所得溶液中加入800-1000μL的Bμffer Rlysis-B溶液振荡均匀，室温放置3分钟；

步骤S3：向步骤S2所获得的裂解液中加入150-250μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；

步骤S4：向上清液中加入其1/3体积的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟或在-20摄氏度下放置30min后，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；

步骤S5：以体积介于600-800μL、浓度介于70-80%的乙醇溶液洗涤沉淀，12000rpm、4摄氏度离心3分钟，小心倒掉上清液，重复此步骤1-2次；

步骤S6：室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或-70摄氏度长期保存。

其中，所述步骤S1还包括，在添加溶菌酶溶解后，另外加入10-20μL乙酸钠及30-60μL 10%SDS溶液。

其中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，在添加溶菌酶溶解后，另外加入10μL乙酸钠及30μL 10%SDS溶液；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，在添加溶菌酶溶解后，另外加入20μL乙酸钠及60μL 10%SDS溶液。

其中，在添加溶解酶溶解后，所添加的乙酸钠的摩尔浓度为3M。

其中，所述步骤S1中，溶菌酶的添加量为300μL；针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度介于3-6mg/mL；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度介于9-12mg/mL。