[发明专利]肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用

说明书

本发明提供了肝前体样细胞系的构建方法以及保藏编号为CCTCC NO：C2019120的肝前体样细胞系。所述构建方法包括以原代肝细胞为种子细胞来构建所述肝前体样细胞系，结合对传代培养、再传代培养、病毒感染、扩增培养和汇合培养的工艺参数进行控制，并通过在永生化细胞系中过表达肝细胞特异性转录因子FOXA3，使得到的所述肝前体样细胞系容易实现良好的肝向分化。本发明还提供了通过所述构建方法得到的肝前体样细胞系在生物人工肝领域的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用。

背景技术

肝衰竭是严重肝病的终末期表现，患者病死率为可高达50％～90％。肝移植是治疗肝衰竭的行之有效的手段，但由于费用昂贵、供体缺乏以及术后免疫排斥反应严重等问题而难以广泛开展。目前，对肝细胞移植和生物人工肝技术的研究取得了一定的进展和技术突破，有望成为治愈肝衰竭的有效治疗手段。

公开号为CN105521482A的中国发明专利申请公开了联合应用不同类型的肝细胞特异性转录因子，例如HNF1α、HNF4α或FOXA3来诱导分化肝癌细胞的方法，揭示了上述肝细胞特异性转录因子在肝癌分化治疗方面具有良好的应用前景。

公开号为CN103981147A的中国发明专利申请公开了一种制备类肝细胞的方法，该方法通过在成纤维细胞等体细胞中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成具有功能的肝实质细胞。然而该方法的种子细胞来源于非肝脏组织，仅通过谱系重编程并不能保证其能够完全实现肝向分化，从而增加了诱导分化的培养成本。

因此，有必要开发一种新型的肝前体样细胞系及其构建方法以避免现有技术中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供容易实现良好肝向分化的肝前体样细胞系及其构建方法以及在生物人工肝领域的应用，以降低培养成本。

为实现上述目的，本发明的所述肝前体样细胞系的构建方法，包括：

S1：提供原代肝细胞培养物，对所述原代肝细胞培养物进行增殖培养和传代培养，以得到待转染细胞培养物，所述传代培养的传代比例1:3-1:6，传代次数为2-30；

S2：将所述待转染细胞培养物以0.5×10⁴-1×10⁵个/平方厘米的接种密度进行汇合培养，以得到汇合率不低于80％的贴壁细胞；

S3：通过慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述贴壁细胞进行病毒感染，并在所述病毒感染的过程中进行培养基置换，所述慢病毒悬液中的慢病毒数量是所述贴壁细胞数量的0.5-50倍，所述病毒感染增强悬液的浓度为6-12微克/毫升；

S4：通过筛选剂和扩增培养基对经所述病毒转染后得到的细胞培养物进行扩增培养和再传代培养，得到永生化细胞系，所述扩增培养的时间为24-96小时，所述再传代培养的传代比例为1:3-1:6，传代次数为10-100；

S5：在所述永生化细胞系中过表达肝细胞特异性转录因子，以得到所述肝前体样细胞系。

本发明还提供了由所述构建方法制备的一种肝前体样细胞系，所述肝前体样细胞系为保藏于中国典型培养位保藏中心的存活样品，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO：C2019120，分类命名为ALI-CELL-85F。

本发明的所述构建方法的有益效果在于：由于所述原代肝细胞培养物来源于肝脏组织，以所述原代肝细胞培养物中的原代肝细胞为种子细胞来构建所述肝前体样细胞系，结合对所述传代培养、所述再传代培养、所述病毒转染、所述扩增培养和所述汇合培养的工艺参数进行控制，并通过在所述转染细胞系中过表达肝细胞特异性转录因子，使得到的所述肝前体样细胞系容易实现良好的肝向分化。