[发明专利]肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用

权利要求书

1.一种肝前体样细胞系的构建方法，其特征在于，包括：

S1：提供原代肝细胞培养物，对所述原代肝细胞培养物进行增殖培养和传代培养，以得到待转染细胞培养物，所述传代培养的传代比例1:3-1:6，传代次数为2-30；

S2：将所述待转染细胞培养物以0.5×10⁴-1×10⁵个/平方厘米的接种密度进行汇合培养，以得到汇合率不低于80%的贴壁细胞；

S3：通过慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述贴壁细胞进行病毒感染，并在所述病毒感染的过程中进行培养基置换，所述慢病毒悬液中的慢病毒数量是所述贴壁细胞数量的0.5-50倍，所述病毒感染增强悬液的浓度为6-12微克/毫升；

S4：通过筛选剂和扩增培养基对经所述病毒转染后得到的细胞培养物进行扩增培养和再传代培养，得到永生化细胞系，所述扩增培养的时间为24-96小时，所述再传代培养的传代比例为1:3-1:6，传代次数为10-100；

S5：在所述永生化细胞系中过表达FOXA3，以得到所述肝前体样细胞系。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用胶原酶灌注法从正常肝组织中分离出所述原代肝细胞培养物。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，将所述原代肝细胞培养物以0.5×10⁴-2×10⁴个/平方厘米的接种密度进行6-12天的所述增殖培养。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在预先用包被液铺板的增殖培养容器中进行所述增殖培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，在预先用包被液铺板的汇合培养容器对所述待转染细胞培养物进行至少24小时的所述汇合培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，向装载有所述贴壁细胞的所述汇合培养容器中加入所述慢病毒悬液和所述病毒感染增强悬液的6-12小时后，进行所述包被液置换。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述包被液置换完毕后，继续对所述贴壁细胞培养24-72小时，以完成所述病毒感染。

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，对经所述病毒感染后得到的细胞培养物进行荧光分析以计算荧光率，当所述荧光率大于90%，执行所述步骤S4。

9.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述慢病毒的表达基因为SV40大T抗原、HPV E6E7基因或端粒酶逆转录酶基因，所述病毒感染增强悬液为聚凝胺悬液。

10.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，将经所述病毒感染后得到的细胞培养物与所述筛选剂混合后转移至扩增培养基中进行所述扩增培养，所述筛选剂与所述扩增培养基的体积比为1:1000。

11.如权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述筛选剂为嘌呤霉素、潮霉素或硫酸新霉素，所述扩增培养基为TEM培养基。

12.一种如权利要求1-11中的任意一项所述的构建方法制备的肝前体样细胞系，其特征在于，所述肝前体样细胞系为保藏于中国典型培养位保藏中心的存活样品，所述肝前体样细胞系的保藏编号为CCTCCNO：C2019120，分类命名为ALI-CELL-85F。

13.一种如权利要求1-11中的任意一项所述的构建方法制备的肝前体样细胞系在生物人工肝反应器领域的应用。