[发明专利]一种高效创制磺酰脲类除草剂抗性玉米的方法及其应用

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种高效创制磺酰脲类除草剂抗性玉米的方法及其应用。本发明提供特异性靶向玉米ALS1和ALS2基因的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体，以及利用该载体进行精确目标DNA定点替换突变创制磺酰脲类除草剂抗性玉米种质的方法。本发明提供的单碱基编辑载体能够实现较高的ALS1和ALS2基因的单碱基突变效率，显著提高了ALS1和ALS2基因定点纯合替换以及磺酰脲类除草剂抗性玉米制备的效率，制备得到的磺酰脲类除草剂抗性玉米可耐受300mg/L的氯磺隆除草剂喷施处理，具有很高的育种和栽培价值。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及特异性靶向玉米ALS1和ALS2基因的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体，以及利用该载体进行精确目标DNA定点替换突变创制磺酰脲类除草剂抗性玉米种质的方法及其应用。

背景技术

杂草在农作物生长过程中，不仅与作物争夺光照、生长空间与营养物质等，还会传播病虫害、释放有毒物质造成粮食减产。中国常年杂草发生面积接近0.97亿公顷，相当于作物种植面积的80％。杂草引起作物减产，造成巨大损失，因此杂草防治极为关键。杂草防除有多种方法，其中，化学防除法(即喷施除草剂)省时省力且效果明显。但是，杂草与农作物共同生长在农田中，除草剂使用不当会对农作物造成药害，极容易导致对除草剂敏感的作物死亡。因此，既要高效地消灭杂草，又不使作物受到药害。通过生物技术方法培育除草剂抗性作物品种为该问题的解决提供了有效途径。其中利用转基因生物技术又是其中的主要方法之一，但是由于转基因过程中引入了外源基因，需要环境、生物与食品安全评估，时间与经济投入成本代价高昂。因此，通过基因编辑定向诱变农作物(如玉米)内源基因突变，在不影响基因应有功能的基础之上，对除草剂产生抗性，具有重要的意义与产业应用价值。

玉米乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)为支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的合成中的关键酶。磺酰脲类除草剂通过抑制ALS活性，阻碍支链氨基酸合成，进而影响蛋白质的合成，致使有丝分裂指数下降，最终使植株组织失绿、黄化，逐渐死亡，从而达到除草的目的。玉米中两个ALS基因，即ZmALS1和ZmALS2基因。将ZmALS2的第165位脯氨酸替换为丝氨酸，会降低玉米对磺酰脲类除草剂的敏感性，从而产生磺酰脲类除草剂抗性玉米，该玉米突变体具备耐磺酰脲类除草剂(如氯磺隆)活性。

CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR，clustered regularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫系统衍生而来的基因编辑技术。该技术通过RNA碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologous directed repair)或非同源末端链接(NHEJ，non-homologous end-joining)，进而实现目的DNA编辑。单碱基编辑技术(Baseeditor)是基于CRISPR系统的新型靶基因定点修饰技术，它不需要产生DNA双链断裂(DSB)及DNA模板就可以对基因组特定碱基进行高效的替换。单碱基编辑技术可以应用于通过精确改变单个碱基实现关键氨基酸的改变。利用基因编辑技术高效制备磺酰脲类除草剂抗性玉米具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高效创制磺酰脲类除草剂抗性玉米的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供特异性靶向玉米ALS1基因和ALS2基因的sgRNA，其识别ALS1基因或ALS2基因的靶位点序列如SEQ ID NO.1所示。